应用于珙桐基因表达定量分析的内参基因的筛选及验证

摘要

实时荧光定量PCR(qPCR)技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、高通量等优点，广泛应用于基因表达分析研究中。选择合适的内参基因是运用qPCR技术准确分析目标基因表达量变化的重要前提。珙桐（Davidia involucrata Baill.）是国家Ⅰ级保护植物，具有极高的观赏价值与科学研究价值。目前，对珙桐的基因表达分析研究日益增多，但有关内参基因的研究尚未见报道。本研究首次以珙桐作为材料，从珙桐果实与种子转录组数据库中选取了8个常用管家基因18SrRNA(18S核糖体RNA)、ACT7（肌动蛋白）、DNAJ（DnaJ蛋白）、EF1a（转录延伸因子）、eIF（翻译起始因子）、GA PDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-TUB（β微管蛋白基因）、UBQ（泛素蛋白）与7个新内参基因BADH（甜菜碱醛脱氢酶）、CAC（网格蛋白衔接蛋白复合物）、CSD（外被体蛋白δ亚基）、hnRNP（核内不均一核糖蛋白）、PP2A（丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶）、SAND（Sand蛋白）、TIP41（分子量为41 kDa的Tap42互作蛋白）作为候选内参基因。运用qPCR技术对15个候选内参基因在珙桐7组不同类型样本（营养器官、生殖器官、不同颜色叶片、不同发育阶段苞片、不同发育阶段种子、正常种子与败育种子、所有组织）中的表达量进行测定，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper3种软件以及几何平均值法对候选内参基因的表达稳定性进行评价，筛选出了适用于不同研究的琪桐内参基因。为进一步证明筛选结果的准确性，在珙桐不同类型样品中，分别利用目标基因DiLTP、DiMYB1、DiLAC对部分内参基因的表达稳定性进行了验证。最后，对珙桐中表达稳定性好的两个新内参基因BADH、CAC进行了克隆。通过以上研究，本文主要得到以下结论:
　　1.不同珙桐组织样品中内参基因的表达稳定性不同，而各自不同组织样品中又有特定的表达相对稳定的内参基因。营养器官样品中，BADH、EF1α、hnRNP是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因;生殖器官样品中，BADH、eIF、CAC是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因;不同颜色叶片样品中，SAND、18S rRNA、eIF是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因;不同发育阶段苞片样品中，TIP41、CAC、CSD是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因;不同发育阶段种子样品中，CAC、CSD、BADH是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因;正常种子与败育种子样品中，SAND、CAC、eIF是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因;所有组织样品中，BADH、CAC、DNAJ是表达稳定性排名前三的基因，适合作为内参基因。总之，所有候选内参基因中，新内参基因的表达稳定性普遍优于常用管家基因，其中新内参基因BADH与CAC较管家基因表现更优。
　　2.基因表达分析中，内参基因的表达稳定性、表达量与选用数目都会对定量结果的准确性产生影响。在珙桐基因表达研究中，应当根据具体的样品类型和目标基因，选择在该试验条件下表达稳定且表达量与目标基因接近的内参基因或内参基因组合进行校准，以提高定量结果的准确性。
　　3.珙桐新内参基因BADH命名为DiBADH，登录号KX655718，基因序列长度966bp，编码322个氨基酸，氨基酸序列与茶树BADH氨基酸序列的相似度最高;珙桐新内参基因CAC命名为DiCAC，登录号KX268525，基因序列长度1317bp，编码438个氨基酸，氨基酸序列与葡萄、可可等植物的CAC氨基酸序列相似度最高。
　　该研究为在珙桐中合理选用内参基因以及准确进行基因表达分析提供了理论基础，也为在其它植物中开发新内参基因资源提供了参考依据。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 实时荧光定量PCR技术简介

1．2 内参基因简介

1．2．1 内参基因研究背景

1．2．2 管家基因研究动态

1．2．3 新内参基因研究动态

1．2．4 内参基因组合研究动态

1．3 内参基因筛选方法

1．4 珙桐概述

1．4．1 珙桐生物学特性简介

1．4．2 珙桐分子生物学研究进展

1．5 研究内容及意义

1．6 技术路线

2 珙桐内参基因筛选

2．1 珙桐样品总RNA提取及cDNA合成

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 结果与分析

2．2 候选内参基因筛选及qPCR引物设计与检测

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 结果与分析

2．3 候选内参基因表达稳定性评价

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．3．3 结果与分析

3 珙桐内参基因筛选结果验证

3．1 实验材料

3．1．1 实验样品

3．1．2 实验试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 样品分类

3．2．2 目标基因引物设计与qPCR扩增

3．2．3 目标基因引物特异性鉴定及扩增效率计算

3．2．4 目标基因相对表达量计算

3．3 结果与分析

3．3．1 目标基因引物扩增效率分析

3．3．2 目标基因引物特异性分析

3．3．3 内参基因表达稳定性验证

4 珙桐内参基因BADH与CAC的克隆及序列分析

4．1 实验材料

4．1．1 实验样品

4．1．2 实验试剂

4．1．3 仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 珙桐内参基因CAC克隆

4．2．2 珙桐内参基因BADH克隆

4．2．3 珙桐内参基因序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 珙桐BADH基因克隆与序列分析

4．3．2 珙桐CAC基因克隆与序列分析

5 讨论

5．1 植物内参基因的筛选

5．2 内参基因表达稳定性评价方法的比较

5．3 珙桐内参基因评价与应用

5．3．1 常用管家基因表达稳定性评价与应用

5．3．2 新内参基因表达稳定性评价与应用

5．3．3 内参基因表达量与内参基因组合评价

5．4 目标基因表达分析

6 研究结论和展望

6．1 研究结论

6．2 研究创新点

6．3 研究展望

参考文献

附录

致谢