双色荧光实时PCR检测慢性乙肝患者PBMC中HBVcccDNA及其评估拉米夫定疗效的价值

摘要

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的最常见的危害性极大的传染性疾病之一。对慢性乙型肝炎的综合治疗包括抗病毒治疗、改善肝功能、抗纤维化及对症支持治疗等。而关键是抗病毒治疗。目前公认有效的抗HBV治疗药物主要是干扰素和以拉米夫定为代表的新一代核苷类药物。随着拉米夫定临床广泛应用，在取得一定疗效的同时也遇到一些问题，如持续应答率不满意、部分病人停药后复发、需长期用药引起的耐药变异等。如何监测拉米夫定抗病毒治疗的效果，指导临床更合理地用药，成为目前迫切需要解决的一个问题。抗病毒疗效受到诸多因素的影响，除治疗前患者谷丙转氨酶(ALT)升高和肝脏炎症活动等因素外，治疗过程中细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBVcovalentlyclosedcircularDNA，HBVcccDNA)的存在与变化及机体免疫功能的改变对疗效的影响近年来也倍受关注。本文研究了外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)中的HBVDNA与HBVcccDNA,和血清Th1/Th2型细胞因子(主要是IL-2、IFN-γ及IL-10)等因素对拉米夫定治疗效果的影响，以进一步证实细胞内HBVcccDNA与机体免疫功能对拉米夫定疗效的评估作用。 第一部分双色荧光实时PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA目的建立双色荧光实时PCR(Duplex-ColorRealTimePolymerasechainreaction,DCRT-PCR)体系同步扩增HBV基因组DNA(HBVgenomeDNA)和HBV共价闭合环状DNA(HBVcccDNA)的方法，并探讨本方法用于检测外周血单个核细胞(PBMCs)中的HBVDNA的可能性和意义。 方法①先建立一种多重PCR方法(MultiplexPolymerasechainreaction；M-PCR)，即以含HBV全基因序列的质粒pGHBV2、HBV阳性血清及PBMCs提取的DNA为模板，把一套扩增乙肝病毒基因组DNA(HBVgenomeDNA)的引物和一套特异性扩增HBVcccDNA的引物掺入到一个PCR体系中进行反应同时扩增HBVDNA和HBVcccDNA。②在M-PCR反应体系的基础上，再引入两条与两个PCR产物各自相配的荧光探针(两条探针的荧光基团分别为HEX和FAM)，在icyclerPCR仪上进行荧光实时PCR扩增。③取30例HBV感染患者的全血，常规分离PBMCs,提取DNA,应用M-PCR及DCRT-PCR方法检测PBMCs中的HBVDNA与HBVcccDNA。 结果创建的M-PCR及DCRT-PCR方法能同时特异性地分别检出HBV基因组DNA和HBVcccDNA。M-PCR法检测30份慢性乙型肝炎患者的PBMCsDNA标本，结果检出HBV基因组DNA者28例(28/30，93.3％)；HBV基因组DNA与HBVcccDNA同时阳性者23例(23/30，76.6％)；检出HBVcccDNA者占检出HBV基因组DNA者的82.1％(23/28)，未发现单独的HBVcccDNA阳性者。DCRT-PCR检测同样的标本，PBMCs中的HBVDNA与HBVcccDNA检出率同M-PCR，HBVDNA与HBVcccDNA含量分别为6.81±0.83与3.74±0.37(阳性标本含量对数值)。 结论成功的创建了能同步检测HBV基因组DNA与HBVcccDNA的多重PCR及双色荧光实时PCR方法。慢性乙型肝炎患者的PBMCs中HBVcccDNA阳性率高，进一步证明了在慢性乙肝患者的PBMCs中存在HBV的复制。 第二部分外周血单个核细胞中HBVDNA和HBVcccDNA与慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗效果的关系目的探讨慢性乙型肝炎拉米夫定治疗前后，外周血单个核细胞中HBVDNA和HBVcccDNA检测与拉米夫定治疗效果之间的关系。 方法对17例拉米夫定治疗48周，获得完全或部分疗效(血清HBVDNA转阴，ALT复常，伴或不伴HBeAg血清转换)的慢性乙型肝炎患者，分别在治疗前和治疗结束时收集全血标本，采用双色荧光实时PCR法检测PBMCs中HBVcccDNA和HBVDNA,并在治疗结束后的1年中对他们进行随访。 结果在17例拉米夫定治疗的患者中，治疗前后PBMCs中的HBVDNA分别检出16例与14例(阴转2例)，含量分别为6.85±0.94与4.11±1.21(阳性标本含量对数值)；治疗前后PBMCs中的HBVcccDNA分别检出11例与9例(阴转2例)，含量分别为3.73±0.44与3.63±0.29。 治疗后的HBVDNA含量较治疗前明显下降(下降两个以上对数级)，而治疗后的HBVcccDNA含量较治疗前无显著性差异(仍在同一对数级)。治疗前PBMCs中的HBVcccDNA占HBVDNA的0.15％，而治疗后PBMCs中的HBVcccDNA占HBVDNA的27.9％。 完全应答组(血清抗HBe阳性)的治疗前与治疗后PBMCs中HBVcccDNA检出率均明显低于部分应答组(血清抗HBe阴性)的检出率(分别为P＜0.05和P＜0.01)；(治疗后1年)复发组(血清HBVDNA阳性)的治疗前与治疗后PBMCs中HBVcccDNA检出率均明显高于未复发组(血清HBVDNA阴性)的检出率(分别为P＜0.05和P＜0.01)。 完全应答组拉米夫定治疗前PBMCs中HBVDNA含量(5.11±2.32)显著低于部分应答组(7.38±0.64)(P＜0.05)。 结论拉米夫定对HBVcccDNA抑制作用甚微。 治疗前PBMCs中HBVcccDNA的检测可以作为拉米夫定疗效的预测指标之一；治疗结束时PBMCs中HBVcccDNA的检测对拉米夫定治疗能否获得持续应答具有预测价值。治疗前血清与PBMCs中HBVDNA的定量检测可以作为拉米夫定疗效的预测指标之一。PBMCsHBVcccDNA检测对指导拉米夫定临床应用的价值优于血清与PBMCsHBVDNA检测。 第三部分血清Th1/Th2型细胞因子与慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗效果的关系目的探讨慢性乙型肝炎拉米夫定治疗前后，血清Th1/Th2型细胞因子水平变化与拉米夫定治疗效果之间的关系。 方法选择接受拉米夫定治疗、并在治疗12个月后获得完全或部分疗效(血清HBVDNA转阴，ALT复常，伴或不伴HBeAg血清转换)的CHB患者17例，分别在治疗前、治疗后3、6、12个月采用双抗体夹心ELISA法检测患者血清IL-2、IFN-γ，IL-10水平。 结果慢性乙肝患者基础血清IL-2、IFN-γ、IL-10水平均高于健康对照者；所有病例在拉米夫定治疗后的血清IL-2、IFN-γ水平较基础水平都有所升高，完全应答组的IL-10水平有所下降；完全应答组治疗前及治疗3个月时血清IL-2、IFN-γ水平均明显高于部分应答组；PBMCs中HBVDNA含量与血清IL-2、IFN--γ水平呈负相关。 结论拉米夫定治疗前与治疗早期血清IL-2、IFN-γ水平可能可以作为其疗效的一个预测因子。CHB患者HBV对PBMCs的侵犯与机体的Th1/Th2失衡密切相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略对照表

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前 言

第一部分双色荧光实时PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA

1.1引言

1.2主要试剂材料与仪器

1.3实验方法

1.4结果与分析

第二部分 外周血单个核细胞中HBVcccDNA与慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗效果的关系

2.1引言

2.2主要试剂材料与仪器

2.3实验方法

2.4结果和分析

第三部分血清Th1/Th2型细胞因子与慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗效果的关系

3.1引言

3.2主要试剂材料与仪器

3.3实验方法

3.4结果与分析

讨 论

结 论

参考文献

综述一 慢性乙型肝炎抗病毒治疗疗效预测因素的研究

综述二 乙型肝炎病毒在外周血单个核细胞中的存在状态及其意义

致 谢

攻读学位期间发表论文