慢性粒细胞白血病急变细胞株多药耐药相关蛋白的蛋白质组学分析及耐药机制研究

摘要

肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种化学结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药。随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。目前医学科学工作者研究肿瘤耐药机制主要是从多药耐药基因表达的产物入手，探讨此类产物引起的耐药机制。主要包括P170糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白、乳腺癌耐药相关蛋白、DNA拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽S转移酶等多药耐药相关蛋白质与肿瘤多药耐药性相关。机制研究显示，肿瘤细胞通过P170糖蛋白、多药耐药相关蛋白和乳腺癌耐药相关蛋白的ATP泵功能使化疗药物摄取减少和外排增多，引起细胞内化疗药物的绝对浓度降低；肺耐药相关蛋白等可阻止以胞核为效应点的药物转运到胞浆中，将进入胞浆的药物转运到运输囊泡中，隔绝药物作用，并以胞吐的方式排出体外；另外，药物靶点在质和量上的改变、肿瘤细胞解毒防御系统和DNA修复系统功能加强，以及细胞代谢的变化和肿瘤细胞抗凋亡能力增强均与肿瘤多药耐药有关。虽然已有的研究揭示了一些肿瘤多药耐药机制，但目前仍然不能完全解释肿瘤多药耐药现象并有效逆转肿瘤细胞的多药耐药。 慢性粒细胞白血病是常见的血液系统恶性肿瘤之一，占白血病的15-25％，各种年龄均可发病，以中年最多见。根据临床进展可分为三期：慢性期，加速期和急变期。急变期为慢粒白血病的终末期，临床表现与急性白血病类似，可有髓外白血病的表现，预后极差，往往数月内死亡，而主要原因为对多种化疗药物不敏感及多药耐药。虽然慢粒多药耐药的发生机制已经被广泛的研究，但耐药机制仍不明了，与耐药相关的蛋白质谱仍未得以构建。阿霉素耐药细胞株K562/A02细胞株是用阿霉素逐步诱导慢粒急变细胞株--K562所建立的具有典型多药耐药特征的慢粒细胞株，K562/A02对阿霉素耐受同时也对长春新碱、高三尖杉酯(HHT)等数种化疗药物产生抗药性，但K562/A02的耐药表型具体涉及到何组耐药相关蛋白以及是否存在新的耐药相关蛋白仍不清楚。本研究以慢粒耐药细胞株K562/A02和其亲本细胞株K562为研究材料，采用蛋白质组学技术试图筛选与白血病耐药相关的蛋白质簇，并寻找新的耐药相关蛋白，为揭示白血病的耐药机制、筛选新的针对耐药蛋白的靶向药物提供实验依据。本研究首先采用一步抽提法制备K562/A02和K562细胞株的总蛋白质，应用双向凝胶电泳技术建立了重复性和分辨率均佳的K562/A02和K562细胞株总蛋白质的双向凝胶电泳图谱；用PDQuest软件对两株细胞蛋白质的双向电泳图谱进行了比较，并采用MAILDI-TOF-MS对差异表达的蛋白质进行质谱分析，获取了MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱，数据库搜索鉴定了全部17个差异表达的蛋白质，其中谷胱甘肽S转移酶(GST)在K562/A02细胞株表达明显上调，说明K562/A02细胞的化疗耐药与其密切相关；此外，一种新的与耐药相关的蛋白质--线粒体ATP酶表达出现明显的下调，对其与K562/A02耐药是否相关及机制进行了深入的追踪研究。 为了证实比较蛋白质组学的研究结果，采用Western印迹及Real-time定量RT-PCR技术对部分差异表达蛋白质在K562/A02和K562细胞株中的表达水平进行了检测，Western印迹结果显示，在K562/A02细胞株，GST蛋白表达较其亲本细胞明显增加；而线粒体ATP酶蛋白表达在K562/A02细胞呈显著降低；Real-time PCR结果显示K562/A02细胞GST mRNA表达较亲本细胞增加了3.72倍，而线粒体ATP酶mRNA较亲本细胞降低了7.07倍。上述观察既从蛋白水平也从mRNA水平验证了蛋白质组学的发现。 为了进一步考证线粒体ATP酶是否与K562/A02的阿霉素耐药相关和揭示线粒体ATP酶表达下调的调控机制，本研究采用甲基化特异性PCR检测了K562/A02和K562细胞株中线粒体ATP酶基因的甲基化水平，并用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷抑制K562/A02细胞株中线粒体ATP酶的甲基化后检测其对阿霉素的耐药性，结果显示，K562/A02和K562细胞株均存在线粒体ATP酶不同程度的甲基化，而耐药株的甲基化程度更高；用5-氮杂胞苷抑制线粒体ATP酶的甲基化可增强K562/A02对阿霉素的化疗敏感性，部分逆转了耐药行为，从而证实线粒体ATP酶为K562/A02的耐药相关蛋白。 本研究在建立K562/A02和。K562细胞蛋白质双向电泳图谱的基础上，采用质谱分析结合数据库搜索共鉴定出17个差异表达蛋白质，其中一些蛋白质是已知的耐药相关蛋白质，如GST，本研究发现线粒体ATP酶是慢粒耐药相关蛋白质，该蛋白在K562/A02的表达降低与其基因CpG岛的过度甲基化调控有关；抑制线粒体ATP酶基因甲基化，可部分逆转K562/A02的耐药行为，提示线粒体ATP酶基因的甲基化干预可能是逆转慢粒白血病细胞株耐药的分子靶标。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表

声明

前言

第一章K562/A02与K562细胞株的差异蛋白质组学分析

1.前言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

5.结论

第二章部分耐药相关蛋白质差异表达的进一步确定及耐药机制研究

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

总结

参考文献

综述 蛋白质组学研究技术原理及其在白血病研究中的应用

致谢

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