肝脏靶向性导入TGF-βsiRNA对急性肝损伤大鼠TGF-β/Smad信号传导通路的影响

摘要

目的:①改良一种肝靶向性给药途径的体外留置性肝动脉插管动物模型；②构建启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的急性肝损伤动物模型；③运用RNAi技术研究TGF-β、TGF-β<,1>R siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预作用；④比较外源基因进入靶细胞四种方式转染效果差异，建立和评价肝动脉插管给药的优越性。 方法: (1)大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型的建立：对Lindell肝动脉插管法进行改进，在10倍手术显微镜下，采用特制内径0.5mm导管(由硬膜外麻醉导管加工而成)经胃十二指肠动脉剪口处插入动脉血管内，逆行到达肝固有动脉开口处后留置导管并固定； (2)肝动脉插管留置及假手术5天后的大鼠急性肝损伤模型：在随后的第1天和第5天，分别予25％四氯化碳花生油溶液(CCl<,4>)6ml/kg体重，腹腔注射，自由饮用水，进食普通颗粒饲料，造成急性肝损伤，第二次四氯化碳48h后处死所有动物； (3)TGF-β<,1>、TGF-β<,1> R siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预实验：针对肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路中的TGF-β<,1>及TβRI、TβRⅡ分别构建三个不同靶点的siRNA，36只模型鼠随机分为6组，每组6只，分别为模型对照(M)组，TGF-β<,1> siRNA干预(T)组，TGF-β<,1> siRNA+TpRI siRNA干预(T+R<,1>)组，TGF-β<,1>siRNA+TβRⅡ siRNA干预(T+R<,2>)组， TGF-β<,1> siRNA+TβRIsiRNA+TβRⅡ siRNA干预(T+R<,1>+R<,2>)组，和空白对照(N)组。实验的第5天(第二次CCl<,4>后约0.5h)，将所需导入的siRNA质粒溶于2 ml林格氏液，由尾静脉注射导入siRNA 50μg(联合用药的则各为50μg)，M组将无关siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液，从尾静脉注射导入；48小时后处死所有大鼠； (4)siRNA质粒四种导入方法的抗肝损伤与抗肝纤维化的疗效比较：30只模型鼠随机分为5组，每组6只，分别为模型对照(M)组、尾静脉直接注射(V)组、脂质体包裹(L)组、流体动力学法(H)组，和肝动脉插管(A)组。在实验的第5天(第二次CCl<,4>后约0.5h)，V组及A组将所需导入的TGF-β<,1> siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液，分别从尾静脉及肝动脉插管导入；L组将所需导入的TGF-β<,1> siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液后，再加入脂质体LipofectamineTM 2000 250μg(脂质体：siRNA质粒为5：1)，室温混合15分钟后，由尾静脉注射导入；H组将所需导入的TGF-β<,1>siRNA质粒50μg溶于容量占自身体重10％的林格氏液中，经45mm头皮注射针尾静脉10秒内快速注射完毕；M组将无关siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液，从尾静脉注射导入；48小时后处死所有大鼠； (5)各实验组大鼠处死后检测：血清指标ALT、AST、HA；肝组织HE染色病理检测；PT-PCR技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、 TGF-β<,1>、Smad<,3>、PCNA和TGF-αmRNA表达；免疫组化技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β<,1>、Smad<,3>、PCNA和TGF-α蛋白的表达。 结果: (1)20只大鼠在构建肝动脉插管并体外留置模型实验中，术中2只因胃十二指肠动脉剪口处血管断裂无法插管；1只手术后死亡，成功者17只，成功率为85％。 (2)急性肝损伤大鼠肝组织中TGF-β/Smad信号传导通路的启动实验中，模型组及肝动脉插管组与空白对照组比较：在血清肝功能指标ALT、AST及肝纤维化指标HA上明显上升(P<0.01)；通过肝组织HE染色病理观测，肝细胞出现明显炎症、变性、坏死，纤维组织增生等现象；PT-PCR检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β<,1>、Smad<,3>mRNA表达显著增强(P<0.01)；免疫组化检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β<,1>、Smad<,3>蛋白的表达增强(P<0.05)；而模型组与肝动脉插管组比较，在以上指标中差异不明显，无统计学意义(P>0.05)；以上表明，通过插管留置或假手术，加上四氯化碳急性损伤，均能成功启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路。 (3)TGF-β<,1>、TGF-β<,1>R siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预实验中，通过实验指标的比较表明：四个治疗组均能有效干预大鼠肝组织TGF-β/Smad信号传导通路，起到抗肝损伤及抑制肝纤维化的效果(P<0.05)；T+R<,1>+R<,2>组效果最好，T组效果最差(P<0.05)；T+R<,1>组与T+R<,2>组间差异无显著性意义(P>0.05)。 (4)siRNA质粒四种导入方法的抗肝损伤与抑制肝纤维化的疗效比较实验中，通过实验指标的比较表明：抗TGF-β<,1>siRNA质粒经过以上四种导入方法转染入靶细胞，均能有效地阻断大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的传导(P<0.05)；四种导入方法比较，肝动脉插管组与脂质体包裹组效果相当(P>0.05)，但优于尾静脉直接注射组及流体动力学法组(P<0.05)，尾静脉直接注射组效果最差(P<0.05)。 结论:①大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型具有创建技术方法简单、肝损伤性小、成功率高的特点；②致急性肝损伤，启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的动物模型能明显观察到肝纤维化过程中关键环节TGF-β/Smad信号传导通路的激活。该模型在评价抗肝纤维化药物及方法时具有耗时少、有效和经济的特点，值得进一步研究；③针对TGF-β/Smad信号传导通路中的TGF-β<,1>及其Ⅰ型受体(TβR Ⅰ)、Ⅱ型受体(TβR Ⅱ)，的siRNA联合治疗对该信号传导通路的干预具有协同作用，联合用药显著高于单靶点用药效果；④siRNA质粒经肝动脉插管途径转染，是一种安全、方便、高效的外源基因肝脏靶向导入转染方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词英汉对照表

声明

前言

第一章 大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型的建立

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

第二章 大鼠肝组织中TGF-β/Smad信号传导通路的启动

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章 多基因多位点siRNA联合对TGF-β/Smad信号传导通路的干预实验

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

附图

第四章 比较不同方法肝脏靶向性导入抗TGF-β1siRNA对TGF-β/Smad信号传导通路影响

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

结论

参考文献

综述：RNA干扰技术及用于肝脏疾患治疗中的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果