代谢组学用于中药质量控制及2型糖尿病诊断与药效跟踪研究

摘要

代谢组学作为后基因时代一种新兴的技术和理念，在药物的药效和毒性评价、药物作用机理研究、疾病诊断、转基因食品的开发、中药现代化等方面展现了广阔的前景。当前代谢组学研究中存在两个难点同时也是热点问题：一是细胞、组织或体液中所有代谢产物的定性、定量分析，二是代谢产物复杂数据分析体系中有用信息的提取。本论文针对这两个问题，利用联用色谱仪器，结合能有效提取和利用复杂二维数据系统中有用信息的化学计量学多元校正、多元分辨和模式识别方法，完成以下六个方面的工作：橘皮不同生长期次生代谢谱中黄酮类成分和挥发油成分的变化分析；陈皮和青皮药材的质量控制研究；2型糖尿病患者早期诊断模型的建立及生物标记物寻找；罗格列酮治疗2型糖尿病患者的血浆游离脂肪酸代谢谱的变化情况跟踪研究；2型糖尿病患者、2型糖尿病合并冠心病患者和健康对照者之间判别模型的建立及生物标记物寻找；血糖、血压及血浆游离脂肪酸相关关系研究。 一、将HPLC-DAD和GC-MS色谱联用技术与化学计量学方法相结合，首次对三种不同种橘皮两类主要次生代谢产物——黄酮类和挥发油在整个生长期的变化情况进行全面分析。采用直观推导式演进特征投影法(HELP)和交互移动窗口因子分析法(AMWFA)对重叠色谱峰进行分辨，对各组分进行定性、定量分析。用主成分分析法对不同种橘皮不同生长期的次生代谢谱进行分析，寻找其次生代谢谱变化的共性和差异性，探询陈皮、青皮作为不同中药使用的物质基础，为陈皮、青皮最佳采收时间的确定和质量控制提供科学依据。 二、在中药色谱指纹图谱的基础上，利用主成分分析和偏最小二乘—线性判别分析，对不同种的陈皮、青皮标本药材和全国11个省、市的商品药材进行考察，建立陈皮、青皮的判别模型及质量控制标准，并筛选出了能有效区分这两种药材的三个化学指标物质，为“成对药材”的判别和质量控制研究开辟了新的思路。 三、采用GC-MS技术，结合化学计量学方法，建立2型糖尿病早期诊断模型并寻找生物标记物。本文发展了一种简单、快速地同时测定人血浆中游离脂肪酸和酯化脂肪酸代谢谱的方法；在此基础上，采用化学计量学模式识别的方法，成功地建立了针对健康对照者和2型糖尿病患者的三维判别模型，所得模型具有良好的预测能力，为2型糖尿病的早期诊断提供了可能；同时，提出一种新的寻找生物标记物的方法--分类特征变量法，筛选出了潜在的特征生物标记物，为研发降糖新药寻找药物靶点提供了新的思路。 四、提出了基于代谢组学研究技术的药效评价策略。利用健康对照者和2型糖尿病患者的三维判别模型，跟踪研究罗格列酮治疗2型糖尿病患者的血浆游离脂肪酸代谢谱的变化情况。该方法能够直观地反映出患者的临床治疗效果与游离脂肪酸代谢谱的变化之间的对应关系，为建立药效的代谢组学评价平台打下了坚实的基础。 五、对健康对照者、2型糖尿病患者和2型糖尿病合并冠心病患者的血浆游离脂肪酸代谢谱进行判别分析，并寻找生物标记物(第七章)。利用非相关判别矢量-线性判别分析法(UDV-LDA)，建立了三类样本两两之间有效的判别模型，其训练和预测的结果均明显优于PCA-LDA和PLS-LDA方法；同时利用转换矩阵找出了潜在的特征生物标记物。所得结果将有助于推动2型糖尿病及冠心病研究的发展以及二者之间相关关系的研究。 六、血糖、血压及血浆游离脂肪酸相关关系研究(第八章)。采用多元线性回归和去一法交互检验等方法，发现并发高血压的患者游离脂肪酸与血糖具有明显的线性关系。我们推测，并发高血压的患者，脂代谢与糖代谢之间很可能存在直接的作用关系。 本论文将代谢组学研究技术与化学计量学紧密结合，对中药陈皮、青皮及2型糖尿病进行了一些基础研究，充分展现了这种结合在疾病诊断、药物的药效评价及中药质量控制等研究方面的优势及巨大潜力。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1引言

1.2代谢组学的应用

1.2.1药物作用(药效和毒性)模型的鉴别和确证

1.2.2药物作用机制的研究

1.2.3疾病诊断

1.2.4植物的代谢组学研究

1.3代谢组学与化学计量学

1.3.1代谢组学分析中的多元分辨方法

1.3.2模式识别分析

1.3.3寻找生物标记物

1.4本文的研究内容

第二章橘皮生长期次生代谢谱黄酮类成分变化

2.1 理论

2.1.1直观推导式演进特征投影法

2.1.2主成分分析法

2.2实验部分

2.2.1样本来源

2.2.2仪器与试剂

2.2.3黄酮类成分的提取

2.2.4对照品溶液的制备

2.2.5色谱条件

2.2.6数据处理

2.3结果与讨论

2.3.1橘皮黄酮类色谱指纹图谱提取、测定条件的优化

2.3.2不同生长期橘皮黄酮类成分色谱指纹图谱

2.3.3橘皮黄酮类成分的定性、定量分析及色谱分辨

2.3.4不同生长期橘皮黄酮类成分变化趋势

2.4本章小结

第三章橘皮生长期次生代谢谱挥发油类成分变化

3.1理论

3.2实验部分

3.2.1仪器与试剂

3.2.2挥发油的提取

3.2.3测定条件

3.2.4数据处理

3.3结果与讨论

3.3.1不同生长期橘皮挥发油色谱指纹图谱

3.3.2橘皮挥发油成分的定性、定量分析及色谱分辨

3.3.3不同生长期橘皮挥发油成分变化趋势

3.4本章小结

第四章陈皮、青皮指纹图谱质量标准的建立

4.1理论部分

4.1.1相似度计算

4.1.2偏最小二乘与偏最小二乘—判别分析

4.1.3基于载荷矢量寻找特征化学成分

4.1.4线性判别分析

4.1.5偏最小二乘(主成分)—线性判别分析

4.2实验部分

4.2.1样本来源

4.2.2数据分析

4.3结果与讨论

4.3.1陈皮、青皮色谱指纹图谱比较

4.3.2用全谱区分“杂果皮”药材与标本药材

4.3.3不同样本间的共有成分

4.3.4标本陈皮、青皮药材的区分

4.3.5特征化学成分的判别能力评价

4.4本章小结

第五章同时分析人血浆中酯化脂肪酸和游离脂肪酸代谢谱

5.1实验部分

5.1.1受试者

5.1.2试剂

5.1.3衍生及提取人体血浆中的脂肪酸

5.1.4方法学考察

5.1.5气相色谱/质谱条件

5.1.6统计分析

5.2结果与讨论

5.2.1衍生及提取方法的优化

5.2.2 GC-MS条件的优化

5.2.3脂肪酸代谢谱的建立

5.2.4健康人与2型糖尿病人脂肪酸代谢谱的分析

5.2.5 2型糖尿病人罗格列酮治疗过程的脂肪酸代谢谱变化情况

5.3本章小结

第六章2型糖尿病人与健康人的判别分析及生物标记物

6.1理论部分

6.1.1变量权重法

6.1.2分类特征变量法用于寻找生物标记物

6.2实验部分

6.2.1实验数据

6.2.2数据分析

6.3结果与讨论

6.3.1健康人与2型糖尿病人的脂肪酸代谢谱

6.3.2 GC/MS数据的主成分分析

6.3.3 2型糖尿病人与健康人的PLS-LDA判别模型

6.3.4 2型糖尿病人罗格列酮治疗过程的游离脂肪酸代谢谱变化情况

6.3.5寻找生物标记物

6.4本章小结

第七章2型糖尿病合并冠心病患者的游离脂肪酸代谢谱

7.1理论部分

7.1.1非相关判别矢量法

7.2实验部分

7.2.1受试者

7.2.2血浆样本分析

7.2.3数据分析

7.3结果与讨论

7.3.1 2型糖尿病合并冠心病人的脂肪酸代谢谱

7.3.2 PCA-LDA和PLS-LDA分析

7.3.3非相关判别矢量—线性判别分析

7.3.4寻找生物标记物

7.4本章小结

第八章血糖、血压及血浆游离脂肪酸相关关系研究

8.1实验部分

8.1.1受试者

8.1.2测定的生化指标及方法

8.1.3血标本的处理与贮存

8.1.4脂肪酸代谢谱的测定

8.1.5数据分析

8.2结果与讨论

8.2.1四组不同病人的各指标比较

8.2.2 T2DM与T2DM-HBP游离脂肪酸与血糖的关系

8.2.3 T2DM-CHD与T2DM-CHD-HBP游离脂肪酸与血糖的关系

8.2.4 T2DM血压与游离脂肪酸及血糖的关系

8.2.5 T2DM-CHD血压与游离脂肪酸及血糖的关系

8.3本章小结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间主要研究成果