TGF-β1/smads通路调控COPD发病过程中气道上皮细胞分泌SLPI的作用机制研究

摘要

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一组严重危害人群健康的常见疾病，近年来，其发病率在全球均有明显上升趋势。COPD发病机制尚未完全阐明，目前多数学者认为弹性蛋白酶一抗蛋白酶失衡是COPD发生、发展的重要机制之一。研究表明，慢性支气管炎患者(无论急性发作与否)其气道腔内中性粒细胞百分数显著高于对照组。同时发现，慢支患者的气流阻塞程度与支气管灌洗液中中性粒细胞数量增多有关。以上研究表明，COPD患者气道腔内存在中性粒细胞的聚集状态，中性粒细胞弹力酶(NE)是中性粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶，被认为是肺炎性损伤级联反应的主要终效应因子，其对肺组织结构蛋白有直接损伤作用，是肺气肿形成过程中的关键作用环节。中性粒细胞聚集导致弹性蛋白酶负荷的增加，从而促进了COPD的发生发展。与蛋白酶相对应，体内的抗蛋白酶主要有：1.α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)，这是肺实质中主要的抗蛋白酶，它由肝脏合成，血浆转运。α1-AT主要对抗中性粒细胞弹性蛋白酶。2.α1-抗糜蛋白酶。3.组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)。该酶主要对抗MMPs。4.分泌性白细胞蛋白酶抑制物(SLPI)，这是气道中最重要的保护基质，它起源于气道上皮细胞，在气道中可起到局部防护作用。国内外研究最多、最透彻的是α1-AT它是人血浆中最主要的抗蛋白酶，但其并不能完成在肺间质中的保护作用；相对而言，目前国内外对源于气道上皮细胞在气道中起到局部最重要防护作用的SLPI的研究却较少，SLPI能够抑制金属蛋白酶的产生，抑制核因子-kB(NF-kB)的活性和减轻炎症反应。SLPI还可以抑制气道上皮细胞中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的水平和白细胞介素8(IL-8)的水平，从而可以中断炎症循环，提示SLPI可能是气道中最重要的保护基质之一。 转化生长因子β1(TGF-β1)也被认为是COPD发病机制中的关键致病因子，其作用机制可能与肺纤维化的形成及气道重构密切关联。已有研究证实，TGF-β受体激活后，由TGF-βI型受体到核内的信号转导主要由Smads蛋白家族的胞浆蛋白磷酸化完成的。被激活的已经磷酸化的Smad2和Smad3只有与Smad4结合形成复合物，才能使TGF-β1信号传导进入细胞核，从而起到生物学效应。然而，在COPD发病过程中，SLPI在支气管肺组织中的如何表达及其是否与TGF-β1存在对应关系尚不清楚，若二者存在对应关系，Smads信号通路是否在此过程中起作用作用。本研究对此进行了探讨。 第一部分：分泌性白细胞蛋白酶抑制物在慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管肺组织中的表达及转化生长因子β1对其影响的研究 采用熏香烟加气管内注射内脂多糖复制大鼠COPD模型，并用TGF-β1单抗干预，测定大鼠的肺功能及病理变化结果，应用酶联免疫法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中SLPI的水平，用免疫组织化学法观察TGF-β1、Smad4、SLPI在支气管肺组织中的表达情况，用逆转录聚合酶链法检测TGF-β1、Smad4和SLPImRNA在支气管肺组织中的表达水平。 结果显示：光镜下可见模型组支气管上皮细胞变性坏死脱落，大量炎症细胞浸润，肺大疱形成，气管及血管壁增厚，管腔狭窄闭塞。干预组可见少量支气管上皮细胞变性坏死脱落，气管及血管壁轻度增厚，少量炎性细胞浸润，管壁未见明显增厚，未见明显肺大疱的形成及管腔狭窄。而正常对照组未见异常。模型组大鼠比对照组大鼠的肺功能明显降低，干预组大鼠比模型组大鼠的肺功能明显增高。TGF-β1在血管和气道平滑肌细胞、支气管、细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺间质细胞以及巨噬细胞均有免疫染色，细胞膜着色。对照组TGF-β1呈弱阳性表达，阳性产物为棕黄色颗粒，模型组TGF-β1呈强阳性表达，阳性产物为棕褐色颗粒，二者的阳性系数和灰度值差异有统计学意义；干预组TGF-β1表达比模型组明显减弱，二者的阳性系数及灰度值差异有统计学意义。Smad4在血管和气道平滑肌细胞、支气管、细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺间质细胞以及巨噬细胞均有免疫染色，细胞质和细胞核均有着色。对照组Smad4呈弱阳性表达，阳性产物为棕黄色颗粒，模型组Smad4呈强阳性表达，阳性产物为棕褐色颗粒，二者的阳性系数和灰度值差异有统计学意义；干预组比模型组Smad4表达明显减弱，二者的阳性系数和灰度值差异有统计学意义。SLPI只在气管、支气管上皮细胞有免疫染色，且仅在细胞质和管腔侧细胞膜有着色。对照组SLPI呈强阳性表达，阳性产物为棕褐色颗粒，模型组SLPI呈弱阳性表达，阳性产物为棕黄色颗粒，二者的阳性系数和灰度值差异有统计学意义；干预组比模型组SLPI表达明显增强，二者的阳性系数和灰度值差异有统计学意义。模型组支气管肺泡灌洗液中SLPI浓度明显低于对照组，差异有统计学意义；干预组支气管肺泡灌洗液中SLPI浓度明显高于模型组，差异有统计学意义。与对照组比较，模型组大鼠支气管肺组织中TGF-β1、Smad4mRNA表达量增高，其吸光度值明显增高，差异有统计学意义；而SLPI mRNA的表达量却很低，其吸光度值明显降低，差异有统计学意义。干预组大鼠支气管肺组织中TGF-β1、Smad4mRNA表达量比模型组明显下降，其吸光度值明显降低，差异有统计学意义；而SLPImRNA的表达量却明显升高，其吸光度值明显增高，差异有统计学意义。 第二部分：Smads信号通路在TGF-β1介导气道上皮细胞SLPI下调中作用的研究 采用Smad4siRNA预处理及TGF-β1进行刺激支气管上皮细胞，免疫细胞化学及westen blot方法观Smad4、SLPI在Smad4siRNA预处理及TGF-β1进行刺激后支气管上皮细胞内的表达情况；RT-PCR法检测在Smad4siRNA预处理及TGF-β1进行刺激后支气管上皮细胞内Smad4mRNA及SLPImRNA的表达水平。 结果显示：SLPI在胞浆胞膜均有免疫染色，在对照组中SLPI呈强阳性表达，染色为棕褐色颗粒，经TGF-β1刺激后，SLPI在刺激组呈弱阳性表达的棕黄色颗粒；Westem blot检测也显示，在对照组中SLPI表达量较高，经TGF-β1刺激后，SLPI在刺激组表达量明显减少，二者差异差异有统计学意义；在对照组中SLPImRNA表达量较高，经TGF-β1刺激后，SLPImRNA在刺激组表达量明显降低，二者差异有统计学意义。Smad4在胞浆胞核均有免疫染色，在对照组中Smad4呈弱阳性表达，染色为棕黄色颗粒，经TGF-β1刺激后，Smad4在刺激组染色呈强阳性表达的棕褐色颗粒；Westem blot检测也显示，在对照组中Smad4表达量较低，经TGF-β1刺激后，Smad4在刺激组表达量明显增高，二者差异有统计学意义；在对照组中Smad4mRNA表达量较低，经TGF-β1刺激后，Smad4mRNA在刺激组表达量明显增高，二者差异有统计学意义。经Smad4siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，Smad4在干扰组的表达比单纯的TGF-β1刺激组的表达明显减弱，染色呈弱阳性表达的棕黄色颗粒；而给予阴性对照siRNMA处理后再给予TGF-β1刺激，则Smad4在HK组的表达比单纯的TGF-β1刺激组的表达减弱不明显，染色仍呈强阳性表达的棕褐色颗粒；Western blot检测也显示，经Smad4siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，Smad4在干扰组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组明显减少，二者差异有统计学意义。而给予阴性对照siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，则Smad4在HK组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组减少不明显，二者差异无统计学意义。经Smad4siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，Smad4mRNA在干扰组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组明显减少，二者差异有统计学意义；而给予阴性对照siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，则Smad4mRNA在HK组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组的表达量减少不明显，二者差异无统计学意义。经Smad4siRNA预处理成功转染后再给予TGF-β1刺激，SLPI在干扰组的表达比单纯的TGF-β1刺激组的表达明显增强，染色呈强阳性表达的棕褐色颗粒；而给予阴性对照siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，则SLPI在HK组的表达比单纯的TGF-β1刺激组的表达增强不明显，染色仍呈弱阳性表达的棕黄色颗粒；Westernblot检测也显示，经Smad4siRNA预处理后再给予TGF-β1刺激，SLPI在干扰组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组明显增高，二者差异有统计学意义；而给予阴性对照siRNA预处理后再给予FGF-β1刺激，则SLPI在HK组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组增高不明显，二者差异无统计学意义。经Smad4siRNA预处理成功转染后再给予TGF-β1刺激，SLPImRNA在干扰组的表达量比单纯的TGF-β1激组明显增高，二者差异有统计学意义；而给予阴性对照siRNA预处理后再给予FGF-β1刺激，则SLPImRNA在HK组的表达量比单纯的TGF-β1刺激组增高不明显，二者差异无统计学意义。 上述二个部分研究提示，COPD大鼠支气管肺组织中SLPI明显减少，可能主要是由于TGF-β1表达增加所致，而且，TGF-β1使支气管上皮细胞SLPI表达下调的作用是通过Smads信号通路介导的。

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论文说明：缩略词表

声明

前言

第一章SLPI在COPD大鼠支气管肺组织中的表达及TGF-β1对其影响

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

第二章 Smads信号通路在TGF-β1介导气道上皮细胞SLPI下调中作用的研究

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

参考文献

综述:COPD气道中SLPI的表达与TGF-β1/smads通路

致谢

攻读学位期间的主要研究成果