环氧合酶-2选择性抑制剂抑制小鼠日本血吸虫性肝纤维化的实验研究

摘要

背景：肝纤维化是各种原因导致肝内细胞外基质(ECM)异常沉积的病理过程。病理特点为汇管区和肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积，以Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维为主。其机制为ECM的合成和降解失调，ECM过度沉积。肝纤维化是日本血吸虫病的重要并发症，最终导致的血吸虫性肝硬化成为血吸虫病致死的重要原因。近年来对肝纤维化机制的研究表明，各种细胞因子通过自分泌和旁分泌相互作用，形成细胞因子网络共同调控肝纤维化的发生。肝纤维化阶段的损害是可预防和可逆转的，目前的许多抗纤维化的药物通过作用于肝纤维化发生的不同环节达到抗纤维化的目的。γ-干扰素(INF-γ)是由活化的T细胞和NK细胞产生。动物实验和临床研究证实INF-γ具有较明显的抗纤维化作用，美国肝病年会正式推荐其为抗肝纤维化的首选药物。但是外源性INF-γ临床运用存在很多不足之处，如不便保存和使用、价格昂贵。人体内影响其药效的因素很多，如半衰期短、诱导抗体产生、与靶器官以外的器官及细胞受体结合等。大剂量使用INF-γ时有较明显的不良反应。 环氧合酶(COX)为花生四烯酸合成前列腺素(PG)的关键限速酶。目前已确定其至少有两种同工酶，即COX-1和COX-2。COX-1正常状态下即存在于胃肠道、肾脏和血小板等组织细胞中，其催化产生的PG主要用于维持生理状况下内环境的平衡。COX-2又称为诱导型酶，在生理状况下仅微量或几乎不表达，而在受到外来刺激时，可在巨噬细胞等细胞中大量产生，此时通过对促进的PG合成，介导疼痛、炎症和发热等反应。非甾体抗炎药(NSAIDs)有很强的消炎镇痛作用，但由于同时抑制了COX-1和COX-2，不良反应较严重，为此人们研发了COX-2选择性抑制药物，其作用和经典的NSAIDs相似，但是副作用却远远低于前者。近年来的研究表明COX-2除了在炎症及癌症方面起重要作用外，同时人们也发现在病毒性肝炎、肝纤维化和肝硬化时肝组织中COX-2表达增强，因此COX-2被作为预防、治疗肝病和肝纤维化的靶点提出。西乐葆(celeaoxib)是第一个高效的COX-2选择性抑制剂，已被美国FDA批准上市，用于治疗风湿病和骨关节炎病。有研究表明西乐葆能显著抑制成纤维细胞的ECM合成以及抑制其分裂、增殖，在体外具有明显的抗纤维化作用。推测西乐葆可能对血吸虫性肝纤维化起到预防作用，有可能成为血吸虫肝硬化的预防新方法。拟在小鼠日本血吸虫动物模型上进行实验以证实这个假设。此类研究国内外尚未见文献报道。 目的：探讨环氧合酶-2选择性抑制剂西乐葆对日本血吸虫性肝纤维化的预防作用，并与INF-γ作一比较。 方法： (1)制备小鼠日本血吸虫性肝纤维化模型，并将小鼠分为：A组(正常对照组)、B组(INF-γ处理组)、C1组(西乐葆10mg/kg·d组)、C2组(西乐葆20mg/kg·d组)、C4组(西乐葆40mg/kg·d组)和D组(感染对照组)； (2)检测小鼠血清总蛋白(TP)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)，并用ELISA法检测各组小鼠血清透明质酸(HA)含量； (3)小鼠肝组织HE、MASSON染色，比较各处理组小鼠肝纤维化程度和血吸虫虫卵肉芽肿的大小； (4)用免疫组织化学法比较各处理组小鼠肝脏TGF-β1、a-SMA表达； (5)用RT-PCR法检测各组小鼠肝脏TGF-β1mRNA。 结果： (1)西乐葆对小鼠死亡率的影响：西乐葆和INF-γ都能降低小鼠死亡率，又以西乐葆20mg/kg·d作用较明显； (2)西乐葆对小鼠肝纤维化有预防作用：西乐葆和INF-γ均有效抑制了肝脏重量的增长，C2和C4组小鼠肝脏重量小于B组；西乐葆和INF-γ都能有效抑制血吸虫虫卵肉芽肿的增长，并显著减少肝脏胶原的沉积；西乐葆和INF-γ都能使肝组织TGF-β1的表达明显降低，C2和C4组小鼠肝脏阳性细胞表达低于C1和B组；在对各组小鼠肝脏TGF-β1mRNA进行RT-PCR检测时也出现同上相同的趋势；西乐葆和INF-γ能使肝组织a-SMA的表达明显减少，西乐葆处理组呈剂量依赖趋势；西乐葆和INF-γ能明显降低血清HA含量； (3)西乐葆对小鼠肝功能的影响：C1组对TP及ALT的影响较INF-γ小，C2组对ALT的影响低于INF-γ，但随着西乐葆用量的增加到40mg/kg·d其对肝功能的影响也随之变大。 结论： (1)西乐葆对于小鼠日本血吸虫性肝纤维化有较明显的预防作用； (2)西乐葆的抗纤维化的作用机制可能是通过对TGF-β1及a-SMA表达的调控实现的； (3)与INF-γ相比西乐葆有类似的抗肝纤维化效果，西乐葆10mg/kg·d和20mg/kg·d对小鼠肝脏功能的不良影响小于INF-γ。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词简表

声明

第一章前言

第二章材料与方法

2.1实验动物

2.2干预药物

2.3主要试剂

2.4主要实验仪器设备

2.5实验技术和方法

2.5.1动物分组

2.5.2感染方法

2.5.3干预方法

2.5.4标本搜集

2.5.5肝脏形态学观察

2.5.6免疫组化染色及结果判断

2.5.7酶联免疫吸附实验(双抗体夹心法)

2.5.8逆转录聚合酶链反应(PT-PCR)

2.6统计学方法

第三章结果

3.1小鼠一般状况

3.2小鼠肝脏大体情况

3.3肝组织的病理变化

3.3.1小鼠肝脏HE染色观察

3.3.2小鼠肝脏MASSON染色观察

3.4小鼠肝组织TGF-β1和a-SMA表达

3.5小鼠血清生化指标

3.6小鼠肝组织TGF-β1mRNA表达

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附图

综述：环氧合酶2肝纤维化关系的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果