NMDA受体激活在急性肺损伤CCTα表达下调中的作用及机制

摘要

第一章 MK801对小鼠油酸型肺损伤的保护作用研究背景急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是临床常见危重疾病，发病机制尚未完全阐明。肺内中性粒细胞、巨噬细胞的滞留和激活在ARDS的发生发展中起重要作用。中性粒细胞、巨噬细胞可释放谷氨酸。Said等人发现谷氨酸离子型受体特异性激动剂N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)可引起离体灌流肺发生高通透性肺水肿。近年来本室的研究还发现NMDA受体阻断剂MK-801对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和高氧等引起的肺损伤具有明显的保护作用，这些研究进一步提示内源性谷氨酸(Glutamate，Glu)的大量释放过度激活NMDA受体参与急性肺损伤的发生发展过程。但为证明内源性Glu的大量释放过度激活NMDA受体在急性肺损伤的发生中具有普遍意义，尚有待在不同模型上进一步证实。 方法：(1)建立小鼠急性油酸肺损伤模型；(2)测量肺湿重和干重的比值(W/D)并观察肺组织病理变化，以反映肿组织的损伤程度；(3)测定支气管肺泡灌洗液中蛋白和白细胞含量，以反映支气管肺泡毛细血管通透性变化；(4)生化测定肿组织髓过氧化物酶(MPO)，反映氧化损伤时的肺炎性改变；(5)RT-PCR和免疫组化分别检测CTP:磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶α(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase alpha，CCTα)mRNA和蛋白水平，反映CCTα转录合成的变化。 结果：油酸(0.1 ml/kg)尾静脉注射4 h可引起肿组织肺指数、肺湿干重比W/D增加、肺组织MPO活性增加，支气管肺泡灌洗液中蛋白和白细胞含量明显增加，并引起肺组织CCTα mRNA和蛋白水平的明显减低，病理切片示水肿、炎症渗出明显。NMDA受体的阻断剂MK-801(0.1mg/kg，ip)预处理30 min可减轻油酸引起的上述变化。 结论：油酸引起明显以炎性渗出为主的急性肿损伤，肺内NMDA受体的激活参与油酸急性肿损伤的发生，并引起CCTα表达的下调。 第二章 研究背景：CTP：磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase alpha，CCTα)是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)合成中的关键调控酶。CCTα基因近端启动子区包含多个与细胞生长、分化密切相关的转录因子Sp1(specificity protein 1)结合位点。探讨Sp1在CCTα启动转录中的作用具有一定的意义。在急性肺损伤(acute lung injury，ALI)及ARDS等肿部损伤疾病中，肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)系统功能的异常并参与肺损伤的发生过程。本室前期研究证明一定剂量NMDA作用后，肺Ⅱ型上皮细胞合成CCT mRNA水平、CCTα蛋白表达水平均下降。本研究旨在观察NMDA受体激活后Sp1的改变，探讨NMDA抑制CCTα表达的分子机制。 方法： (1)萤光素酶报告基因活性检测CCTα启动子活性；(2)荧光定量PCR定量检测Sp1表达质粒后CCTα mRNA；(3)Westem blot检测A549细胞转染Sp1表达质粒后CCTα蛋白含量表达水平；(4)Westem blot检测A549细胞经NMDA处理后Sp1蛋白含量表达水平；(5)荧光定量PCR定量检测A549细胞经NMDA处理后Sp1mRNA水平；(6)EMSA检测CCTα启动子上Sp1的DNA结合活性及NMDA处理对其影响。 结果 转染Sp1真核表达质粒30 h后，A549细胞CCTα核心启动子报告基因相对萤光素酶活性增加，A549细胞CCTα m RNA表达水平表达水平增高。转染Sp1真核表达质粒36 h后，CCTα蛋白表达水平表达水平增高。A549细胞经NMDA处理8 h后，Sp1蛋白表达明显下降，并呈时间、剂量依赖。Sp1 mRNA水平没有明显的改变。EMSA检测显示，NMDA处理后A549细胞的核蛋白中转录因子Sp1与DNA的结合活性下调。 结论 转录因子Sp1促进A549细胞CCTα的启动子活性，增加CCTα的合成表达。NMDA通过下调核内Sp1蛋白与DNA结合活性而抑制CCTα的表达。

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论文说明：缩略语表

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前言

第一章MK801对小鼠油酸型肺损伤的保护作用

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

1.5附图

第二章NMDA抑制CCTα表达的转录调控机制研究

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

参考文献

综述 CTP：膦酸胆碱胞苷酰转移酶α功能与表达调节

致谢

攻读学位期间主要的研究成果