哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)促进肾脏衰老的机制研究

摘要

肾脏功能随着年龄增长逐渐下降，老年人慢性肾脏疾病的发生率高，且治疗有效率低，死亡率高，所以研究肾脏衰老的机制和寻找延缓肾脏衰老的策略对老年肾脏损害的防治有重要意义。肾脏衰老的特征是随年龄增长出现肾小球肥大、系膜增生、肾小球硬化和肾小管-间质纤维化等病理变化。但出现这一现象的分子机制并不完全清楚。近年来有学者发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特异性的抑制剂雷帕霉素可抑制肾小球肥大及肾小管-间质的炎症和纤维化。另外，越来越的证据表明mTOR与细胞及机体衰老有着千丝万缕的联系，因此我们推断，mTOR参与了肾脏病变发生发展的过程，其表达异常可能在肾脏衰老过程中发挥着某种作用。为此本研究首先观察mTOR在不同月龄大鼠肾脏组织的表达情况；并培养不同月龄的原代大鼠系膜细胞及WI-38细胞，观察mTOR在细胞中随龄表达变化；再以细胞周期为切入点，进一步研究mTOR在细胞衰老进程中的作用机制。 目的：研究mTOR在大鼠系膜细胞/肾组织中随增龄的表达变化及在细胞衰老过程中的作用机制。 方法：取3月龄、12月龄和24月龄大鼠的肾脏组织，用RT-PCR及Western blot的方法，观测mTOR mRNA和蛋白质的表达变化；用免疫组化法观察mTOR在肾组织中的定位和表达。并分离培养各时间点大鼠肾脏系膜细胞及WI38细胞，观测mTOR mRNA和蛋白质及其他衰老相关指标在细胞随龄的变化情况，用免疫荧光法检测mTOR的定位和表达变化。应用mTOR的激动剂和抑制剂分别干预WI38细胞，检测衰老的相关指标，包括用β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色方法检测了衰老相关SA-β-gal染色阳性率，用流式细胞仪检测了细胞周期的变化及细胞大小，并计数了细胞分裂的代数等。并利用激光共聚焦技术观察mTOR与细胞周期负向调控蛋白p21WAF1/CIP1/SDI1之间的关系，从而进一步明确mTOR在细胞衰老过程中的作用机制。 结果：①、mTOR在肾小球系膜基质及肾小管-间质表达，其mRNA和蛋白表达水平及磷酸化的活性蛋白随增龄逐渐上升，且其与增龄引起的肾脏病变有显著相关性。②、mTOR在细胞胞浆及胞核皆有表达，在不同细胞（大鼠原代系膜细胞及人胚肺二倍体成纤维细胞）衰老过程中，其表达随月龄/代龄的增加而逐渐增强。③、mTOR的激动剂能上调P21WAF1/CIP1/SDI1及Cyclin D1基因及蛋白质的表达，引起细胞周期阻滞，促进细胞肥大，缩短细胞的传代次数；mTOR的抑制剂能下调P21WAF1/CIP1/SDI1及Cyclin D1基因及蛋白质的表达，减慢细胞生长及分化速度，缩小细胞体积，延长细胞的传代次数。 结论：在大鼠肾脏中，mTOR的表达随着增龄而上升，在肾脏衰老中起重要作用。它能增加能量代谢，促进蛋白质合成，致使细胞肥大；并且通过对P21WAF1/CIP1/SDI1的调节，参与G1期细胞周期阻滞，调控细胞衰老乃至肾脏衰老的进程。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

实验研究一哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在大鼠肾脏随增龄的表达变化

实验研究二哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在细胞衰老过程中的表达变化

实验研究三哺乳动物雷帕霉素靶蛋白对P21WAF1/CIP1/SDI1的调控作用及对细胞周期的影响

全文总结

研究特色及创新点

综述mTOR信号通路与肾脏衰老

致谢

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