活性氧通路在高糖诱导人腹膜间皮细胞分泌转化生长因子β1中的作用

摘要

背景:
　　持续不卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritonealdialysis,CAPD)是目前终末期肾病的主要替代治疗方法之一,长期透析治疗所导致的腹膜纤维化(peritoneal dialysis,PF)和超滤衰竭(ultrafiltration failure,UFF)是患者退出腹膜透析的主要原因。国内外大量研究证实,腹透液中高浓度葡萄糖的长期应用是导致腹膜透析相关性腹膜纤维化的重要原因,然而其具体发生机制至今尚未完全阐明。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是生物体内一类活性含氧化合物的总称,主要包括超氧阴离子自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH-)、单线态氧(1O2)和过氧化脂质(LOOH)等。ROS除了能直接发挥细胞毒性作用外,还能作为信号传递分子通过影响细胞内信号转导系统来调控某些基因的表达。
　　在糖尿病肾病研究中已经证实ROS可通过激活信号转导途径如蛋白激酶C(PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及转录因子如核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1),并上调转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纤维连接素(FN)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)等基因和蛋白的表达来介导肾脏纤维化。TGF-β1是目前公认的一种强效致纤维化因子,在高糖诱导腹膜纤维化的形成过程中起着非常重要的作用。因而我们猜测,ROS可能作为细胞内信号转导分子在高糖诱导人腹膜间皮细胞(humanperitoneal mesothelial cells,HPMCs)分泌TGF-β1过程中起到一定的介导作用,但是目前尚缺乏直接的研究证据。目的:本实验拟通过研究高糖对体外培养的人腹膜间皮细胞分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)以及产生细胞内活性氧(ROS)的影响,同时应用不同浓度的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对其进行干预,以探讨ROS信号通路在高糖诱导人腹膜间皮细胞分泌TGF-β1过程中的作用。
　　方法:
　　采用胰蛋白酶消化法从人网膜组织标本中分离HPMCs,用15％FBS-DMEM培养基于37℃,5%CO2培养箱中培养,并进行倒置相差显微镜和免疫细胞化学染色鉴定,第三代细胞用于实验。根据不同的实验要求将HPMCs随机分组:
　　1.高糖组(含1.5%、2.5%、4.25%D-葡萄糖),同时设正常无血清DMEM培养液为对照组(含0.1%D-葡萄糖),各组细胞分别培养24h;对照组与1.5%高糖组分别培养12h、24h和48h;
　　2.NAC处理组(含0.1mM、1.0mM、10mM NAC),同时设不含NAC的正常无血清DMEM培养液为空白对照组(含0mMNAC),各组细胞分别用NAC预处理1h,然后再用1.5%高糖培养24h。
　　检测方法:
　　1.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测各组样品细胞培养上清液中TGF-β1的蛋白分泌量;
　　2.腹膜间皮细胞原位装载荧光探针2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)后,采用DCF法检测各组样品细胞中ROS的生成量:①用荧光显微镜直接观察各组样品细胞中DCF的荧光强度;②用多功能酶标仪测定各组样品细胞中DCF的相对荧光强度(relative fluorescence intensity,RFI),从而间接反映细胞内ROS的相对水平。
　　结果:
　　1.经鉴定,96%以上的培养细胞为HPMCs。
　　2.高糖可显著诱导人腹膜间皮细胞分泌TGF-β1,并呈浓度及时间依赖性(P<0.05),其中4.25%高糖组及培养48h组诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1蛋白分泌量最高。
　　3.高糖可显著刺激人腹膜间皮细胞生成活性氧(ROS),并呈浓度及时间依赖性(P<0.05),其中4.25%高糖组及培养48h组刺激人腹膜间皮细胞内ROS生成量最高。
　　4.抗氧化剂NAC预处理细胞后,可明显降低细胞内ROS的生成量,同时显著抑制TGF-β1的分泌,并呈浓度依赖性(P<0.05),其中10mM NAC组抑制作用最明显。
　　结论:
　　1.高糖可显著诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1分泌增加,抗氧化剂可抑制高糖诱导的TGF-β1分泌。
　　2.高糖可显著刺激人腹膜间皮细胞内ROS生成增加,抗氧化剂可抑制高糖诱导的ROS生成。
　　3.综上可见,ROS信号通路在高糖诱导人腹膜间皮细胞分泌TGF-β1过程中起到重要的介导作用。

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定

2.2.2 实验分组

2.2.3 TGF-β_1蛋白的检测

2.2.4 细胞内活性氧的检测

2.3 统计学处理

第三章 结果

3.1 人腹膜间皮细胞的鉴定

3.1.1 形态学鉴定

3.1.2 免疫细胞化学鉴定

3.2 高糖对HPMCs培养液中TGF-β_1蛋白质水平的影响

3.2.1 葡萄糖浓度对HPMCs培养液中TGF-β_1蛋白质水平的影响

3.2.2 刺激时间对HPMCs培养液中TGF-β_1蛋白质水平的影响

3.2.3 NAC对高糖诱导HPMCs分泌TGF-β_1的影响

3.3 高糖对HPMCs内ROS生成的影响

3.3.1 葡萄糖浓度对HPMCs内ROS生成的影响

3.3.2 刺激时间对HPMCs内ROS生成的影响

3.3.3 NAC对高糖诱导HPMCs内ROS生成的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间的主要研究成果