冬凌草甲素对PC-3细胞的增殖抑制、凋亡诱导和转移抑制作用及分子机制

摘要

前列腺癌是一种老年男性高发疾病，在西方国家，前列腺癌是男性第二大恶性肿瘤，仅次于肺癌。中国近年来发病率稳步升高，已列为泌尿系肿瘤的第三位，并且发病年龄也日趋年轻化。大部分前列腺癌病人在经历18～24个月的中位期后，原来对激素依赖的前列腺癌最终成为激素非依赖性前列腺癌。对激素、化疗、和放疗不敏感也是激素非依赖性前列腺癌治疗过程中面临的难题。因此，寻找新的治疗方法仍是当前研究的热点。冬凌革甲素是从冬凌草等植物中提取出来的一种天然活性物质，具有抗炎、抗DNA突变、抗氧化作用。目前研究证明，冬凌草甲素对多种肿瘤具有生长抑制作用，有望成为一种高效、低毒的新型抗肿瘤药物。本研究用冬凌草甲素作用于人前列腺癌细胞株--PC-3细胞株，观察冬凌草甲素对PC-3细胞是否具有抑制增殖、凋亡诱导和转移抑制作用，并对其分子机制进行部分揭示。 第一章冬凌草甲素对PC-3细胞的增殖抑制效应 目的：确定冬凌草甲素是否具有抑制PC-3细胞增殖的能力。 方法：用不同浓度的冬凌草甲素干预PC-3细胞，通过台盼蓝拒染试验、MTT试验和细胞的药物浓度-时间生长曲线分析观察其对PC-3细胞活力的影响；通过流式细胞仪检测PC-3细胞的细胞周期变化。 结果：（1）冬凌草甲素能以时间和浓度依赖性方式有效的抑制PC-3细胞增殖，药物抑制PC-3细胞活力的IC50约为10.29μmol/L。（2）冬凌草甲素能增加PC-3细胞G0/G1期百分率，降低PC-3细胞S期百分率，细胞增殖指数下降。 结论：冬凌草甲素能够有效的抑制PC-3细胞的增殖，并呈时间和药物浓度依赖性。 第二章冬凌草甲素对PC-3细胞的凋亡诱导效应 目的：确定冬凌草甲素是否能诱导PC-3细胞凋亡。 方法：用不同浓度的冬凌草甲素作用于PC-3细胞，用Hochest33258染色鉴定PC-3细胞凋亡的形态学特征；用流式细胞仪分析PC-3早期凋亡细胞的百分率；用Caspase-3蛋白印迹分析证明PC-3细胞凋亡发生的分子特征。 结果：（1）凋亡细胞形态学鉴定、流式细胞仪检测均有力证明冬凌草甲素能以浓度依赖性方式诱导PC-3细胞凋亡。（2）冬凌草甲素诱导PC-3细胞凋亡伴有Caspase-3蛋白表达上调和裂解激活。 结论：冬凌草甲素能以浓度依赖性方式诱导PC-3细胞凋亡。 第三章冬凌草甲素对PC-3细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制 目的：（1）揭示冬凌草甲素抑制PC-3细胞增殖与细胞周期改变的关系；（2）部分揭示冬凌草甲素对PC-3细胞凋亡诱导的分子机制；（3）确定Caspase-3活化在冬凌草甲素诱导的PC-3细胞凋亡中的重要作用。 方法：（1）流式细胞仪检测细胞周期变化；（2）Western印迹检测COX-2、Survivin、Bcl-2和Bax蛋白表达的变化；（3）实时荧光定量PCR方法检测PC-3细胞COX-2、Survivin、CyclinD2、CyclinE、P27蛋白表达的变化；（4）Z-IETD-fmk阻断试验检测Caspase-3阻断后，冬凌草甲素对PC-3细胞凋亡影响的变化。 结果：（1）冬凌草甲素增加G0/G1期PC-3细胞百分率，降低S期PC-3细胞百分率；（2）冬凌草甲素以浓度依赖性方式抑制PC-3细胞的COX-2、Survivin、CyclinD2、CyclinE、和Bcl-2蛋白表达，而P27和Bax蛋白表达上调；（3）冬凌草甲素以浓度依赖性方式抑制PC-3细胞端粒酶的活性；（4）Z-IETD-fmk阻断Caspase-3活性后，能部分逆转和减弱冬凌草甲素对PC-3细胞的凋亡诱导作用。结论：冬凌草甲素通过影响细胞周期调节蛋白、阻断细胞周期G1/S期“稽查点”；抑制COX-2、Survivin、CyclinD2、CyclinE和Bcl-2，上调P27和Bax以及活化Caspase-3等途径抑制PC-3细胞增殖及诱导PC-3细胞凋亡。 第四章冬凌草甲素对PC-3细胞转移的抑制效应和分子机制 目的：确定冬凌草甲素是否具有抑制PC-3细胞转移的能力及其分子机制。 方法：用不同浓度的冬凌草甲素作用于PC-3细胞，用体外驱化运动试验检测PC-3细胞运动驱化能力的变化；用实时荧光定量PCR方法检测PC-3细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表达的变化；用ELISA方法检测PC-3细胞上清VEGF、MMP-2和MMP-9浓度的变化。 结果：（1）体外驱化运动试验证明冬凌草甲素能以浓度依赖性方式抑制PC-3细胞转移。（2）冬凌草甲素以浓度依赖性方式抑制PC-3细胞及其上清中VEGF、MMP-2和MMP-9的表达。 结论：冬凌草甲素具有抑制PC-3细胞转移的能力，其机制可能与药物下调VEGF、MMP-2和MMP-9有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章冬凌草甲素对PC-3细胞的增殖抑制效应

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

第二章冬凌草甲素对PC-3细胞的凋亡诱导效应

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

第三章冬凌草甲素对PC-3细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

第四章冬凌草甲素对PC-3细胞转移的抑制效应和分子机制

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

全文总结

参考文献

综述一 雄激素非依赖性前列腺癌的治疗进展

综述二 冬凌草甲素的研究进展

致谢

在读期间发表的文章和科研成果