SNAP29在人类成熟中性粒细胞的表达、亚细胞定位与功能研究

摘要

背景与目的： 本实验继续研究可能存在于人类PMN的其他SNARE蛋白及其亚细胞分布，首次发现SNAP29表达于人类PMN，并分布于中性粒细胞TG与SG膜。至于VAMP1，VAMP2与syntaxin4，因其与SNAP29组成SNARE复合体，调节PMN胞裂外排，故再次验证其在PMN的表达与亚细胞分布。过去的研究还发现，某些SNARE蛋白的编码基因在PMN表达A，B两种亚型，本实验合成新的引物，扩增长片段基因与过去未测序的基因片段，并克隆与测序，研究VAMP1，VAMP2与syntaxin4是否表达亚型。 方法： (1)采用免疫印迹实验，研究SNAP29蛋白在PMN内的表达。 (2)采用基因克隆与测序，研究SNAP29基因在PMN内的表达。 (3)用人髓系白血病细胞株HL60细胞做研究模型，研究SNAP29蛋白/基因表达于HL60细胞。 半定量RT-PCR研究HL60细胞向PMN分化过程中，SNAP29mRNA表达水平的变化。 上述实验为SNAP29蛋白/基因表达于PMN进一步提供佐证。 (4)PMN去核总蛋白、膜蛋白与胞质溶胶，用免疫印迹分析法研究SNAP29是否为膜结合蛋白。 (5)蔗糖密度梯度离心分离PMN各亚细胞器，分析各亚细胞部分特异性标记物活性与溶菌酶活性。各亚细胞部分进行免疫印迹实验，研究SNAP29蛋白在静息PMN的亚细胞分布。 (6)15-nm金标的抗胞浆颗粒标记物抗体标记不同胞浆颗粒，10-nm金标的抗SNAP29抗体标记SNAP29阳性颗粒，结合免疫电镜检测术，分析SNAP29与各胞浆颗粒标记物共存于同一颗粒，进一步研究SNAP29蛋白在静息PMN的亚细胞分布。 结果： (1)免疫印迹实验表明，SNAP29蛋白表达于人PMN。 (2)基因克隆与测序表明，SNAP29基因表达于人PMN。 Syntaxin4 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，显示两条电泳带，分别为1278与1414 bp，基因测序表明，下带碱基序列与Genbank收录的syntaxin4基因序列完全一致，而上带为下带碱基序列中插入136个核苷酸的内含子。 (3)SNAP29蛋白/基因表达于HL60细胞。半定量RT-PCR研究显示，在HL60细胞向PMN分化过程中，SNAP29mRNA表达水平上调，并于DMSO诱导分化4天后，其表达水平近似于PMN的表达水平.进一步证实了SNAP29蛋白/基因表达于PMN，并提示SNAP29蛋白可能是PMN发挥某些生理功能的必需蛋白。 (4)SNAP29为膜结合蛋白。 (5)①各亚细胞部分特异性标记物活性测定结果显示，第1部分含胞质溶浆；第2、3部分含胞浆膜；第4、5部分含TG；第5、6部分含SG；第7、8部分含AG。 ②溶菌酶活性测定结果显示，溶菌酶主要位于静息PMN第4、5、6、7、8亚细胞部分，即TG、SG与AG。但PMN经PMA活化后，第4、5、6部分溶菌酶活性显著降低，第8部分溶菌酶仍然最高。表明PMA动员TG与SG转位至胞浆膜，但较少动员AG转位。 ⑧免疫印迹实验结果发现，在静息PMN，SNAP29位于第4，5，6部分，即TG与SG膜。VAMP1位于第4，5，6，7，8部分，即TG、SG与AG膜；VAMP2位于第4，5，6部分，即TG与SG膜；syntaxin4位于第2，3部分，即胞浆膜。 在PMA活化的PMN，SNAP29从第4，5，6部分转位至第2，3部分，即胞浆膜；位于第4，5，6部分的VAMP1转位至胞浆膜，而位于第7，8部分的VAMP1不发生转位；VAMP2从第4，5，6部分转位至胞浆膜；syntaxin4仍位于第2，3部分，即胞浆膜。 (6)胶体金双标胞浆颗粒结合免疫电镜检测结果表明，SNAP29位于TG与SG膜。VAMP1位于TG、SG与AG膜；VAMP2位于TG与SG膜；syntaxin4位于胞浆膜。 结论： (1)SNAP29(VAMP1，VAMP2与syntaxin4)蛋白表达于人PNN。 (2)SNAP29(VAMP1，VAMP2与syntaxin4)基因表达于人PMN。 (3)SNAP29位于静息中性粒细胞TG与SG膜。VAMP1位于TG、SG与AG膜；VAMP2位于TG与SG膜；syntaxin4位于胞浆膜。 背景与目的： 人类中性粒细胞含三级颗粒、特异性颗粒、嗜苯胺蓝颗粒与分泌囊泡，不同颗粒被动员的难易程度存在显著差异，其中TG与SG易于动员，一旦PMN活化即发生胞裂外排，调节PMN的粘附、渗出与杀微生物效应；AG最不易被动员，其胞裂外排常发生于对吞噬小体的处理过程中。PMN不同胞浆颗粒被动员的难易程度不同，提示机体存在某种机制，对PMN不同颗粒的分泌进行精确调控。 方法： (1)制备电通透的PMN，孵育不同剂量的抗SNAP29抗体，然后用Ca2++GTP-γ-S活化电通透的PMN，多聚甲醛固定，用抗CD66b或抗CD63的抗体孵育细胞，再孵育FITC偶联的荧光二抗，流式细胞术检测抗SNAP29抗体对细胞活化引起的细胞表面CD66b或CD63上调的抑制效应，研究SNAP29是否调节TG、SG与AG分泌。 (2)联合应用抗SNAP29与其他抗体孵育电通透的PMN，研究两种抗体对细胞活化引起的细胞表面CD66b或CD63上调的协同抑制效应，并推断SNAP29在调节胞浆颗粒分泌过程中可能形成的SNARE复合体。 (3)免疫共沉淀研究PMN胞浆颗粒分泌过程中可能形成的SNARE复合体。经PMA活化的PMN制备蛋白溶浆，用预先结合有抗SNAP29抗体的protein A-Sepharose免疫沉淀PMN活化过程中可能形成的含SNAP29的SNARE复合体。免疫沉淀物用于免疫印迹实验，用抗VAMP1，抗VAMP2或抗syntaxin4等抗体探测SNAP29的同源SNARE蛋白。 结果： (1)抗SNAP29与抗VAMP2均剂量依赖性抑制PMN活化引起的细胞表面CD66b上调，但两者均不抑制CD63上调，表明SNAP29与VAMP2均调节TG与SG分泌，但均不调节AG分泌。 (2)联合应用抗SNAP29与抗VAMP1，协同抑制CD66b上调，但对CD63上调的抑制效应，与单用VAMP1相同，表明SNAP29可能与TG及SG上的VAMP1形成SNARE复合体，调节TG与SG分泌，但AG的分泌受VAMP1调节，而不受SNAP29调节。 联合应用抗SNAP29与抗VAMP2，协同抑制CD66b上调，但不抑制CD63上调，表明SNAP29与VAMP2可能形成SNARE复合体，调节TG与SG分泌，但两者均不调节AG分泌。 联合应用抗SNAP29与抗syntaxin4，协同抑制CD66b上调，但对CD63上调的抑制效应，与单用syntaxin4相同，表明SNAP29与syntaxin4可能形成SNARE复合体，调节TG与SG分泌，但AG的分泌受syntaxin4调节，而不受SNAP29调节。 (3)免疫共沉淀实验结果显示，PMA活化的PMN蛋白溶浆，抗SNAP29抗体能免疫沉淀VAMP1，VAMP2与syntaxin4，表明SNAP29能与VAMP1，VAMP2和syntaxin4中任一蛋白形成SNARE复合体，调节TG与SG胞裂外排。 抗VAMP2抗体能免疫沉淀SNAP29与syntaxin4，但不能免疫沉淀VAMP1，表明VAMP2能与SNAP29和syntaxin4中任一蛋白形成SNARE复合体，调节TG与SG胞裂外排，但VAMP2与VAMP1不形成SNARE复合体。 抗syntaxin4抗体能免疫沉淀SNAP29，VAMP1与VAMP2，表明syntaxin4能与SNAP29，VAMP1和VAMP2中任一蛋白形成SNARE复合体，调节TG与SG胞裂外排。 fMLP活化的PMN蛋白溶浆，抗syntaxin4抗体能免疫沉淀SNAP29，VAMP1与VAMP2，且沉淀VAMP1的量，显著多于PMA活化的PMN蛋白溶浆中沉淀的VAMP1的量，表明syntaxin4不仅与TG及SG上的VAMP1形成SNARE复合体，调节TG与SG分泌，而且与AG上的VAMP1形成SNARE复合体，调节AG分泌。 综合免疫共沉淀实验结果，SNAP29可能形成两个SNARE复合体，即：SNAP29/VAMP1/syntaxin4与SNAP29/VAMP2/syntaxin4，调节TG与SG分泌。VAMP1与syntaxin4亦可能形成SNARE复合体，调节AG分泌。VAMP1与VAMP2不共存于同一个SNARE复合体。 结论： (1)SNAP29，VAMP1，VAMP2与syntaxin4皆调节PMN胞浆颗粒分泌。 (2)SNAP29与VAMP2调节TG与SG分泌；VAMP1与syntaxin4调节TG、SG与AG分泌。 (3)两个SNARE复合体，SNAP29/VAMP1/syntaxin4与SNAP29/VAMP2/syntaxin4，调节TG与SG分泌。VAMP1与syntaxin4形成SNARE复合体，调节AG分泌。VAMP1与VAMP2不共存于同一SNARE复合体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

声明

第一部分SNAP29在人类成熟中性粒细胞的表达与亚细胞定位研究

1.前言

2.材料与方法

2.1主要试剂

2.2主要仪器

2.3PMN分离与活化

2.4总蛋白提取

2.5免疫印迹实验

2.6总RNA提取

2.7RT-PCR实验

2.8mRNA半定量实验

2.9基因克隆与测序

2.10HL60细胞培养与流式细胞术

2.11亚细胞器(膜)分离

2.12亚细胞器成分鉴定

2.13免疫电镜术

2.14统计分析

3.结果

3.1SNAP29（及VAMP1,VAMP2与syntaxin4）蛋白表达于PMN

3.2SNAP29（及VAMP1,VAMP2与syntaxin4）基因表达于PMN

3.3SNAP29(及VAMP1,VAMP2与syntaxin4)蛋白／基因表达于HL60细胞

3.4分化过程中的HL60细胞及PMN mRNA半定量实验

3.5亚细胞器成分鉴定

3.6SNAP29(及VAMP1,VAMP2与syntaxin4)亚细胞定位

3.7SNAP29(及VAMP1,VAMP2与syntaxin4)蛋白免疫电镜术定位

4.附图

5.讨论

6.结论

参考文献

第二部分两个SNARE复合体，SNAP29／VAMP1／syntaxin4与SNAP29／VAMP2／syntaxin4,调节中性粒细胞三级颗粒与特异性颗粒胞裂外排

1.前言

2.材料与方法

2.1主要试剂

2.2主要仪器设备

2.3PMN分离

2.4PMN电通透化处理

2.5电通透化的PMN胞浆膜通透性检测及抗体孵育

2.6PMN活化

2.7流式细胞术

2.8免疫共沉淀

2.9免疫印迹实验

2.10统计分析

3.结果

3.1电通透的PMN通透能力检测

3.2SNAP29调节中性粒细胞TG与SG胞裂外排

3.3SNAP29与VAMP1或VAMP2协同调节TG与SG胞裂外排

3.4Syntaxin4与SNAP29，VAMP1或VAMP2协同调节TG与SG胞裂外排

3.5SNAP29，VAMP1，VAMP2与syntaxin4在其他刺激物引起的PMN脱颗粒过程中发挥调节作用

3.6两个SNARE复合体，SNAP29／VAMP1／syntaxin4与SNAP29／VAMP2／syntaxin4，调节TG与SG胞裂外排

4.附图

5.讨论

6.结论

参考文献

综述一SNARE蛋白对免疫细胞功能的调节作用

综述二中性粒细胞颗粒与先天免疫性蛋白

致谢

攻读博士学位期间发表的主要论文及其他研究工作

附录