胚胎后肾间充质细胞移植治疗阿霉素慢性肾病大鼠的实验研究

摘要

目的：研究胚胎后肾间充质细胞(metanephric mesenchymal cells，MMCs)尾静脉移植对阿霉素(Adriamycin，ADR)慢性肾病大鼠损伤肾脏的再生修复作用及其可能机制。 方法： 1.大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴定。取孕13天大鼠胚胎，分离胚胎肾脏，去除输尿管芽，消化后置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察培养细胞，并行HE染色、电镜观察、生长曲线测定；ABC免疫酶染色法检测波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34；直接免疫荧光法检测双花扁豆凝集素(Dolichos Biflorus，DB)，并流式细胞术定量检测。 2.大鼠胚胎后肾间充质细胞的体外标记方法探讨。分别将4’，6-二脒-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、DAPI体外标记MMCs、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)体外标记MMCs，通过尾静脉注入阿霉素肾病大鼠体内；于细胞移植后1w、3w、5w行肾组织冰冻切片，观察DAPI及GFP荧光分布，并ABC免疫酶染色法检测肾组织中GFP表达。 3.从细胞分化的角度，探讨尾静脉细胞移植对阿霉素肾病大鼠的修复改善作用。(1)分别以含阿霉素肾病大鼠血清及肾组织匀浆的培养基，体外诱导培养后肾间充质细胞，采用细胞免疫化学方法检测细胞角蛋白(cytokeratin，CK)、角蛋白-18(cytokeratin-18，CK-18)、波形蛋白、维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)表达。(2)通过尾静脉注射移植GFP标记MMCs至阿霉素肾病大鼠，CK及GFP双标记观察MMCs的归巢及分化情况。(3)检测阿霉素大鼠细胞移植前后24小时尿蛋白定量、24小时尿肌酐定量、血清白蛋白、总胆固醇、尿素氮、肌酐、肾小管损伤指数及肾小球硬化面积等指标，并计算内生肌酐清除率，了解MMCs对肾功能的影响。 4.探讨胚胎后肾间充质细胞移植对阿霉素肾病大鼠的治疗作用。90只体重200～220.Sprague-Dawley大鼠随机分成3组：阿霉素肾病组(ADR group，n=40)：采用阿霉素二次注射法，间隔3周，每次剂量为0.25 mg/10.g体重；MMCs细胞移植组(ADR-MMCs group，n=40)：于第二次阿霉素注射后8周，尾静脉注入MMCs，剂量为每只大鼠5～7×106；正常对照组(control group，n=10)。于阿霉素注射后16周杀鼠，留取标本行血、尿生化检测、肾组织病理学分析，免疫组化法检测肾组织IV型胶原、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，NMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表达，并Western blot及RT-PCR进一步检测肾组织MMP-2、MMP-9的蛋白及基因定量。 结果： 1.MMCs形态为成纤维细胞样，贴壁生长，48～72小时达生长高峰；波形蛋白、nestin、CD133表达阳性；角蛋白、CD34、DB表达阴性；MMCs以DB标记后流式细胞检测为单峰。 2.(1)DAPI标记细胞及单纯DAPI尾静脉注射后1周，均可在肾小管上皮细胞中观察到DAPI阳性细胞，至移植后5周仍可观察到，但随时间延长荧光有减弱趋势。(2)GFP标记细胞移植后1周，可在肾小管上皮细胞中观察到GFP阳性细胞，至移植后5周仍可观察到，荧光无明显减弱。(3)ABC免疫酶染色法检测，显示GFP阳性细胞主要表达于近端肾小管中，肾小球系膜区亦可观察到少量表达；GFP阳性产物主要表达于胞浆。GFP表达半定量评分显示，标记细胞的早期应用阳性率大于晚期应用者，且随观察时间延长，阳性率有升高趋势。 3.(1)MMCs在阿霉素肾病大鼠血清及匀浆体外诱导培养下，均可检测到CK-18、VDR阳性表达。(2)GFP标记MMCs移植后1周，于阿霉素肾病大鼠肾小管及肾小球中，均可检测到GFP、CK双标记阳性细胞。(3)阿霉素肾病大鼠MMCs移植后，内生肌酐清除率提高，但其它指标检测(24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肾小管损伤指数及肾小球硬化面积)与细胞移植前比较，均无显著性差异。另外，血尿素氮、肌酐在阿霉素作用前后无显著性差异。 4.与阿霉素组比较，细胞移植组大鼠肾组织IV型胶原沉积减少、MMP-2蛋白表达下调、MMP-9蛋白表达升高，并有显著性差异(P<0.05)；相关分析显示，IV型胶原沉积与MMP-2蛋白表达存在正相关，而与MMP-9蛋白表达呈负相关(P<0.05)；血、尿生化指标检测同第三部分类似，细胞移植组与阿霉素组在24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肾小管损伤指数及肾小球硬化面积检测上，均无显著性差异。另外，血尿素氮、肌酐在大鼠阿霉素作用前后无显著性差异。 结论： 1.培养细胞为后肾间充质细胞，纯度及稳定性较高并符合干细胞特征。 2.MMCs的脂质体感染法GFP标记，是一便捷、有效的体外标记方法，适于移植细胞的短期内示踪、观察，并可为其它干细胞移植提供参考。 3.在阿霉素肾病大鼠，细胞移植的疗效观察应有一更长的时间；细胞移植能否促进肾脏修复、最终改善肾功能，仍有待进一步的探讨。 4.MMCs移植对改善阿霉素肾病大鼠肾组织纤维化有促进作用，基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解途径的激活可能在其中发挥了作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴定

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 大鼠胚胎后肾间充质细胞的体外标记方法探讨

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

Part 3：Injection of Metanephric Mesenchymal Cells in Adriamycin Induced Chronic Glomerulopathy in Rats

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS AND DISCUSSION

REFERENCES

Figure Legends

第四部分 大鼠胚胎后肾间充质细胞移植对阿霉素肾病大鼠的治疗作用

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述 干细胞治疗慢性肾脏病的几个关键实验问题

致谢

攻读学位期间主要研究成果