日本血吸虫重组蛋白抗原RPS4诊断血吸虫病的研究

摘要

研究背景: 日本血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，主要流行于发展中国家。目前，在我国湖区5省和山区2省仍广泛流行。血吸虫病的快速诊断的研究对于传染源的监测，疫情的控制将起到积极作用。一般认为，血吸虫病现场应用的理想的诊断、筛查方法应具备以下特点：特异、敏感、价廉、简便、稳定和快速。我国血吸虫病的现场查病仍然以粪检（kato-katz法）和IHA（Indirect hemagglutination test）、凝集试验、ELISA等方法为主。由于粪检费时费力，阳性检出率较低，尤其在轻度流行区漏检率高，已不适宜于大面积疫区人群的筛查。目前的IHA、ELISA试剂，基于粗抗原而制备，易出现假阳性和交叉反应。因此，研究快速、特异性高、准确、成本较低、简便易行的新型诊断技术和诊断方法，已成为当前血吸虫病诊断迫切需要解决的问题。 研究目的: 通过本室保存的pQE30/SjRPS4原核表达质粒，在大肠杆菌M15中诱导表达，经Ni-NTA柱纯化重组蛋白，对纯化产物进行免疫活性分析；建立基于均一重组蛋白抗原的间接ELISA方法，用于日本血吸虫流行区人群血清检测，为日本血吸虫病快速检测及流行病学筛查提供方法。 研究方法: 1、大量表达并纯化日本血吸虫核糖体蛋白S4，对其诊断价值作初步鉴定。 大量培养带有pQE30/SjRPS4质粒的M15大肠杆菌，IPTG诱导SjRPS4表达。用Ni-NTA树脂的FAST START COLUMN形式纯化带有6个组氨酸的重组目的蛋白，然后进行复性。通过BCA法测定纯化蛋白浓度。用Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性。 2、建立SjRPS4间接ELISA方法。 用纯化的重组蛋白SjRPS4为包被抗原建立间接ELISA方法，并优化间接ELISA最佳工作条件和确定阴阳性标准对照。 3、间接ELISA方法在血吸虫病流行区的现场应用。 日本血吸虫病流行疫区汨罗市白塘乡中仁义村、双义村、大塘村和木屯村四个乡村采集日本血吸虫感染可疑病人血清。用间接ELISA方法与间接血凝方法同时检测104份血清，评价重组蛋白抗原在血清学诊断中的价值。 研究结果: 1、SDS-PAGE分析显示，在IPTG诱导下，pQE30/SjRPS4质粒重组工程菌表达相对分子质量（Mr）约31ku的目的蛋白，在菌体细胞内主要以包涵体形式存在，表达的目的蛋白占菌体总量的20％-30％。用Ni-NTA柱纯化SjRPS4后得到纯度为95％以上的目的蛋白，Western blotting检测其能与日本血吸虫病人阳性血清发生特异性反应。 2、以30μg/mL SjRPS4重组蛋白包被微孔板建立间接ELISA方法，阴阳性样品的临界值为0.122；检测16例肺吸虫病人阳性血清，无一例出现交叉反应。 3、SjRPS4的间接ELISA方法在血吸虫病流行区的现场诊断，与IHA同时检测104份日本血吸虫病流行疫区的血清，敏感性为90.91％（70/77），特异性为92.59％（25/27），一致率为91.35％。 结论: 1、大量表达并纯化了重组蛋白SjRPS4，并证实其具有良好的免疫反应性，能与日本血吸虫病阳性血清特异性结合，可应用于日本血吸虫感染血清学诊断。 2、成功建立了以重组蛋白SjRPS4为包被抗原的间接ELISA法，在日本血吸虫病的免疫诊断中具有良好的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一章日本血吸虫核糖体蛋白S4(SjRPS4)原核表达、纯化以及免疫反应特性的研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二章基于日本血吸虫重组抗原SjRPS4间接ELISA检测方法的建立

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

综 述：日本血吸虫calpain蛋白研究进展

附 录

致 谢

攻读学位论文期间主要研究成果