采用定量蛋白质组学技术筛选白血病细胞株中的甲基化沉默基因

摘要

背景与目的：白血病是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居儿童恶性肿瘤之首，严重威胁着人类健康，但白血病的发病机制还不太清楚。大量研究表明，白血病的发生发展是多因素参与、多步骤的复杂过程，涉及遗传学和表观遗传学改变。近年来的研究发现，DNA异常甲基化是人类肿瘤中最常见的基因变化之一，它作为肿瘤“二次打击”经典假说的重要补充，已成为新的肿瘤研究热点之一。因此，筛选新的白血病甲基化沉默基因，将有助于揭示白血病的发病机制，为白血病的防治提供重要的理论依据和科学基础。 方法：应用荧光差异双向凝胶电泳（2-D DIGE）分离甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2-dC）处理与未处理的人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞的总蛋白质，Decyder和PDquest图像分析软件识别差异表达蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异表达蛋白质，采用Western blotting和RT-PCR检测4个差异蛋白质（Galectin-1、HSP47、S100A8、S100A9）的表达，验证定量蛋白质组学研究结果；在此基础上，以4株白血病细胞系为样本，采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）、RT-PCR和Western blotting方法分析2个在5-aza-2-dC处理后表达上调的基因（Galectin-1、HSP47）是否为甲基化沉默基因。 结果： （1）建立了5-aza-2-dC处理与未处理的HL-60细胞蛋白质的2-D DIGE图谱，图像分析识别了53个差异表达的蛋白质点，质谱分析鉴定了40个差异表达的蛋白质，其中包括Galectin-1在内的34个蛋白质在5-aza-2-dC处理后的HL-60细胞中表达上调，6个蛋白质表达下调； （2）采用RT-PCR和Western blotting方法检测4个表达上调基因（Galectin-1、HSP47、S100A8、S100A9）在5-aza-2dC处理与未处理HL-60细胞中的表达水平，结果与定量蛋白质组学结果一致。 （3）采用MS-PCR、RT-PCR和Western blotting方法分析2个经过表达验证了的基因（Galectin-1、HSP47）是否为甲基化沉默基因。MS-PCR分析结果显示，5-aza-2dC处理4株白血病细胞系后，Galectin-1和HSP47启动子非甲基化水平上调，而甲基化水平下调，RT-PCR结果显示：5-aza-2dC处理4株白血病细胞系后，Galectin-1和HSP47的mRNA和蛋白表达水平均上调，提示Galectin-1和HSP47基因为白血病细胞中的甲基化沉默基因。 结论： 1.建立了5-aza-2-dC处理与未处理的HL-60细胞蛋白质的2-D DIGE图谱，质谱鉴定了40个差异表达蛋白，其中34个蛋白质在5-aza-2-dC处理后表达上调； 2.采用2D-DIGE技术与MS-PCR检测技术相结合的方法发现并初步证实Galectin-1和HSP47基因为人白血病细胞株的甲基化沉默基因，启动子甲基化是导致Galectin-1和HSP47基因表达下调的主要原因。本文研究结果为白血病的表观遗传学研究提供了有价值的信息。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词简表

声明

前言

技术路线

材料与方法

1.材料

2方法

结果

1、5-aza-2dC处理HL-60细胞后的形态学变化

2、荧光差异双向凝胶电泳蛋白表达图谱的建立与分析

3、差异蛋白质点的质谱分析

4、Western blotting验证部分差异表达蛋白质的表达水平

5、RT-PCR检测部分差异表达蛋白质的表达水平

6、四株白血病细胞系中Galectin-1基因甲基化状态及其对基因表达水平的影响

7、四株白血病细胞系中HSP47基因甲基化状态及其对基因表达水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述：Galectin-1在肿瘤发病中的作用

致谢

攻读学位期间主要的研究成果