采用基因芯片技术筛选急性髓系白血病细胞中的甲基化沉默基因

摘要

背景与目的：白血病是由细胞增殖和分化成熟失衡所引起一种常见的造血系统恶性疾病，其发生发展是多因素参与、多步骤的复杂过程，涉及遗传学和表观遗传学改变。DNA甲基化是基因表达调控最常见的表观遗传学机制之一，异常甲基化基因不仅在白血病发病中起着重要作用，而且可能是白血病的特异性治疗靶标。因此，筛选新的白血病甲基化沉默基因，将有助于揭示白血病的发病机制，为白血病的防治提供重要的理论依据和科学基础。 方法：以急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)细胞系HL-60为对象，应用甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-2dC)处理HL-60细胞，采用MTT比色试验、流式细胞术、瑞氏染色及Hochest33342染色观察5-aza-2dC对HL-60细胞的生长，细胞周期，分化及凋亡的影响；采用人类全基因组U133+2.0芯片比较5-aza-2dC处HL-60细胞前后基因表达谱的变化，采用RT-PCR法验证基因芯片的结果，MSP法检测基因启动子区域CpG岛甲基化情况，筛选AML细胞中的甲基化沉默基因。 结果：1.5-aza-2dC呈剂量和时间依赖性地抑制HL-60细胞的生长，阻滞HL-60细胞于G2/M期，诱导HL-60细胞凋亡，并增强HL-60细胞的髓系分化抗原CD11b的表达，促进HL-60细胞向成熟粒细胞分化。5-aza-2dC在低浓度(0.5 μmol/L)时促分化作用最明显，而在高浓度(5.0 μmol/L)时诱导凋亡的作用最明显；2.采用基因芯片技术筛选到117个差异表达基因，其中109个基因在5-aza-2dC处理后表达上调，8个表达下调，差异基因的功能涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、Toll样受体信号通路和组氨酸代谢通路等；3.采用RT-PCR法检测12个表达上调基因(ANXA2，CTNND1，S100A9，S100A8，NQ01，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1，THBS1，BCSC1)在5-aza-2dC处理HL-60细胞前后的表达水平，结果与基因芯片分析结果一致；4。采用MSP法检测8个经过表达验证了的基因(ANXA2，CTNND1，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1，THBS1)启动子的甲基化情况，结果显示经5-aza-2dC处理后，其启动子非甲基化水平上调，而甲基化水平下调，提示这8个基因为HL-60细胞中的甲基化沉默基因。 结论：1.甲基化转移酶抑制剂5-aza-2dC能抑制急性髓系白血病细胞HL-60的生长，阻滞HL-60细胞于G2/M期，并能促进HL-60细胞分化和诱导其凋亡，这些作用可能与5-aza-2dC抗急性髓系白血病作用有关；2.采用基因芯片技术比较了甲基化转移酶抑制剂5-aza-2dC处理HL-60细胞与对照细胞的基因组表达谱差异，筛选到117个差异基因，其中109个表达上调，8个表达下调。3.采用基因芯片与MSP检测技术相结合的方法筛选HL-60细胞中的甲基化沉默基因，发现并初步证实了HL-60细胞中的8个甲基化沉默基因：ANXA2，CTNND1，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1和THBS1。4.本研究首次报道ANXA2，CTNND1，GLIPR1，EPAS1，PRF1，PHLDA1基因为白血病细胞中的甲基化沉默基因。本文研究结果为揭示白血病的发病机制及其防治提供了重要的理论依据和科学基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表

声明

前言

技术路线

第一章5-杂氮-2’-脱氧胞苷抗白血病作用的体外研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

第二章采用基因芯片技术筛选急性髓系白血病细胞中的甲基化沉默基因

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

结论

参考文献

综述：DNA甲基化与白血病研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果