TGF-β1诱导的Fascin1基因表达对胃癌细胞侵袭和转移影响的研究

摘要

前言：胃癌是一种常见的恶性肿瘤，据有关文献报道，在我国其死亡率居各种恶性肿瘤之首。胃癌患者的主要死因为肿瘤病灶的侵袭及转移。因此探讨其侵袭转移机制显得尤为重要。 在众多的促转移分子中，转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)是一重要分子，它参与了多种肿瘤的侵袭和转移过程。用基因转染的方法诱导肿瘤细胞中TGF-β1表达可增加肿瘤细胞的转移能力。同时有研究表明，阻止TGF-β信号通路可以抑制胃癌的转移。我们的早期研究发现TGF-β1可以促进胃癌细胞SGC7901和BGC823的浸润和转移。一些临床研究也显示：TGF-β1的表达与淋巴结的转移和预后不良呈正相关。目前虽然已有许多研究证实了TGF-β1在肿瘤侵袭和转移中的作用，但其具体机制尚不明确。 研究表明TGF-β促浸润转移作用可由smad依赖通路及smad非依赖通路介导。TGF-β与细胞膜II型受体(Tβ RII)结合后，激活I型受体，活化的I型受体激活下游分子smad2和smad3，随后smad2/smad3与smad4结合形成smad复合物并转移到核内，调节TGF-β介导的靶基因转录。而在smad非依赖通路中，JNK，Erk和P38通路则被认为是关键性的通路。基于TGF-β在肿瘤发生与转移中的重要性，所以深入探讨TGF-β促转移机制具有非常重要的理论及临床意义。 人类fascin1基因属于fascin家族，其蛋白质编码产物是一种分子量为55 kDa的细胞骨架蛋白，可与F肌动蛋白结合，定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶( ruffles)边缘与细胞的运动、癌细胞的转移有密切关系的公状伪足、微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。细胞内fascin1基因表达上调引起细胞间连接发生解离，同时细胞的运动也相应增加。而将fascin1基因转染至fascin l基因低表达的结直肠癌细胞系SW1222中，结果细胞膜表面突起增多，细胞分化程度降低，细胞运动性增强。Fascin蛋白在胃癌中表达明显增高，它的高表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和复发密切相关。有研究表明在肺癌中TGF-β1可诱导fascinl基因表达上调，且TGF-β1和fascinl蛋白都与肺癌的侵袭与转移有关，但是目前TGF-β与fascinl在胃癌侵袭与转移中是否存在调控关系尚未见文献报道。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发展起来的一种新技术，由于它能特异而有效地阻断靶基因的表达，目前被广泛应用于各种肿瘤的研究。我们构建了针对Fascinl的短发夹RNA(shortharpin RNA，shRNA)真核表达载体并首次转染人胃癌细胞MKN45，观察抑制fascinl表达前后，TGF-β1作用对胃癌侵袭和转移的影响，并对其机制作初步探讨。 目的：研究TGF-β1对fascinl基因表达的影响，以及fascinl在TGF-β促胃癌侵袭与转移中的作用。探讨以fascinl为靶的胃癌基因治疗以及进一步揭示TGF-B1促胃癌侵袭和转移机制提供理论和实验依据。 方法： 1.通过细菌转化、质粒提取、酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定和基因重组技术等方法构建针对Fascinl的RNAi质粒pGen-1-FSCN1和阴性对照质粒pGen-1-con。 2.利用脂质体介导转染技术转染人胃癌细胞MKN45，经G418筛选得到稳定抑制fascinl表达的胃癌细胞模型(pGen-1-FSCN1细胞)；分别采用逆转录聚合酶链反应( RT-PCR)和Western blotting检测RNAi组(siFascinl)、对照组(CON)及未转染组(NT)三组细胞中Fascinl的表达。 3.以10ng/ml的TGFβ1处理siFascinl，CON，NT三组胃癌细胞，观察处理前后各组细胞生物学行为的变化，采用MTT比色法测定细胞的黏附能力，Boyden小室测定法测定转染细胞的迁移能力和侵袭能力；腹腔移植法建立裸鼠胃癌细胞转移模型。 4.分别瞬时转染smad2，smad4的siRNA(small interfering RNA)，检测smad依赖通路在TGF-β诱导fascinl促胃癌浸润与转移中的作用；应用JNK，Erk和P38通路的特异性抑制剂检测smad非依赖通路在TGF-β诱导fascinl促胃癌浸润与转移中的作用。 结果： 1.TGF-β1(10ng/ml)在作用于MKN45细胞24小时后，fascinl基因表达约为0小时的2.2倍。 2.限制性酶切及基因测序证实成功构建了针对fascinl基因的RNAi载体pGen-1-FSCNl。经G418筛选，RT-PCR及Western blotting鉴定，成功建立了稳定抑制fascinl基因表达的胃癌细胞模型。 3.与CON和NT比较，siFascinl细胞的黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力明显降低(p<0.05)：三组细胞经TGF-β1(10ng/ml)预处理后，其中CON与NT细胞黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力明显增高(p<0.05)；而在siFascinl组，TGF-β1处理前后细胞黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力无明显变化( p>0.05)0 4.分别瞬时转染smad2，smad4的siRNA于MKN45细胞中，予TGF-β1处理后，经western blotting检测发现，MKN45中smad2，smad4的表达水平较未转染前减少约70％，而在干扰smad2，smad4后，MKN45细胞中的fascinl表达无明显变化；选用JNK，Erk和P38通路的特异性抑制剂，SP600125，PD98095和SB203580分别预孵育MKN45细胞1h，结果发现：SP600125和PD98095组予TGF-β1处理24小时后，fascinl的表达明显降低(p<0.05)，而P38通路的特异性抑制剂SB203580对fascinl的表达无明显影响。 结论： 1.首次证实，在胃癌细胞MKN45中fascinl基因表达受外源性TGF-β1(10ng/ml)调控。 2.成功构建了针对fascinl基因的RNAi质粒pGen-1-FSCN1，建立了稳定抑制fascinl基因表达的胃癌细胞模型。 3.稳定抑制fascinl基因表达后，TGF-β1促胃癌细胞侵袭和转移能力下降。 4.TGF-β1主要通过JNK和Erk通路诱导fascinl基因促进胃癌的侵袭和转移。

目录

文摘

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论文说明：英文缩写注解(Alphabatic)

声明

技术路线

第一章TGF-β1诱导的fascin1表达对胃癌细胞MKN45侵袭转移的影响

1.前言

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计方法

3.结果

3.1TGF-β1对MKN45细胞fascin1基因表达的影响

3.1质粒pGenesil-1的BamHI+HindⅢ双酶切线性化

3.2质粒pGen-1-FSCN1的SalI单酶切鉴定

3.3测序证实

3.4稳定抑制fascin1表达的胃癌细胞克隆的建立

3.5外源性TGFβ1对瘤细胞粘附基质能力的影响

3.6外源性TGFβ1对瘤细胞侵袭能力的影响

3.7外源性TGFβ1对瘤细胞迁移能力的影响

3.8Fascin1siRNA转染对胃癌MKN45细胞转移能力的影响

4.讨论

5.小结

第二章TGF-β1诱导fascin1基因促胃癌细胞侵袭和转移的分子机制研究

1.前言

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2试验方法

2.3统计学处理

3结果

4.讨论

5.小结

总结论

参考文献

综述一：Fascin1的研究进展

综述二 Testin的研究进展

致谢

攻读博士学位期间主要的研究成果和荣誉