长沙地区MRSA的流行病学研究及femA基因的克隆和原核表达

摘要

目的：(1)了解长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌的耐药特征及对甲氧西林耐药现状，为临床合理应用抗菌药物提供实验依据；(2)评价苯唑西林纸片扩散法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、头孢西丁琼脂稀释法以及显色培养法检测MRSA的临床应用价值；(3)分析长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌的遗传背景，探讨其分子流行病学特征；(4)构建金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femA的原核表达载体并在大肠杆菌中表达，为进一步研究femA基因的生物学功能和临床应用奠定基础。
　　 方法：(1)收集长沙地区11家医院临床分离293株金黄色葡萄球菌，应用Vitek-2全自动微生物分析系统进行鉴定；应用聚合酶链反应(PCR)扩增金黄色葡萄球菌femA基因，对分离菌株进行基因确证；采用纸片扩散法（K-B法）检测金黄色葡萄球菌对23种抗菌药物的敏感性、产色头孢菌素试验检测β-内酰胺酶以及双纸片扩散法（D试验）检测诱导型克林霉素耐药。(2)采用苯唑西林纸片扩散法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、头孢西丁琼脂稀释法以及显色培养法检测MRSA，并与PCR检测mecA基因作对比研究。(3)采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对金黄色葡萄球菌进行同源性分析。(4)Whonet5.4及SPSS11.3软件对结果进行统计分析。(5)根据GenBank中的femA序列，利用Primer Premier5.0设计PCR引物，并在引物的5’加入BamH1及Sal1酶切位点，PCR扩增出femA基因片段。将目的DNA片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒DNA并鉴定。将鉴定正确的pQE30-femA重组质粒转化大肠杆菌JM109进行目的蛋白质的表达，并采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证。
　　 结果：(1)293株金黄色葡萄球菌中，β-内酰胺酶阳性273株(93.2％)；红霉素耐药而克林霉素敏感的28株菌中，D试验阳性26株(92.9％)。(2)在被检测的23种药物中，耐药率大于50.0％的达14种。其中，青霉素和氨苄西林耐药率最高，均为96.6％；其次为红霉素和克林霉素，耐药率分别为77.1％和67.2％。敏感率高于50.0％的仅7种，以替考拉宁、万古霉素和利奈唑胺的敏感率最高，均为100％；其次为呋喃妥因、氯霉素和多西环素，敏感率分别为97.6％、91.8％和71.0％。(3)293株金黄色葡萄球菌对23种抗菌药物共有93种耐药谱型，以PX1和PX2型最多，分别为47株(16.0％)和35株(11.9％)，二者占所有菌株的28.0％(82/293)，是主要的流行耐药谱型；(4)293株金黄色葡萄球菌中，MRSA190株(64.8％)，MSSA103株(35.2％)。MRSA对18种抗菌药物的耐药率明显高于MSSA(P＜0.05)。(5)湘雅医院2006年、2007年和2008年分离菌株对头孢西丁耐药率不同，分别为66.7％、85.0％和63.1％(P＜0.05)，对其他22种药物耐药率三年无明显差异(P＞0.05)。(6)在被检测的23种抗菌药物中，湘雅医院不同病区来源菌株对其中13种抗菌药物的耐药率存在明显差异(P＜0.05)，而长沙地区同一时期不同医院分离菌株对其中15种抗菌药物的耐药率差异明显(P＜0.05)。(7)苯唑西林(OXA)和头孢西丁(FOX)MIC范围分别为0.125μg/ml～＞256μg/ml和2μg/ml～＞256μg/ml，二者MIC50和MIC90均≥256μg/ml。(8)以mecA基因检测为标准，5种检测MRSA的方法敏感性和特异性均超过95.5％，无统计学差异(P＞0.005)。(9)115株金黄色葡萄球菌共有39个PFGE分型，A型56株(48.7％)，是主要的流行菌株，其中55株为MRSA；其次为L型，共5株(4.3％)。A型分为A1～A13共13个亚型，其中又以A1亚型为主，共计26株，占22.6％(26/115)，是主要的流行克隆；在11家医院中，有8家医院分离到A型菌株，并且在湘雅医院3年均分离到A1和A4亚型菌株。(10)经PCR、双酶切鉴定及序列测定，证实重组质粒pQE30-femA构建成功；重组质粒pQE30-femA转化大肠杆菌JM109IPTG诱导后，SDS-PAGE和Western blot分析显示表达出53KD目的蛋白；经Bandscan软件分析，目的蛋白质在4小时的表达量占细胞总蛋白的27.5％。
　　 结论：(1)长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌多重耐药现象十分严重，对甲氧西林呈高水平耐药；β-内酰胺酶阳性率、克林霉素诱导型耐药率及MRSA分离率均较高。(2)长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌以PX1和PX2耐药谱型为主，不同病区以及不同医院分离的金黄色葡萄球菌对多种抗菌药物耐药率存在明显差异。(3)5种表型方法均可用于检测MRSA，头孢西丁纸片扩散法简便、可靠，可作为临床实验室常规检测MRSA的方法。(4)长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌存在A型菌株暴发流行，A1亚型是其主要的流行克隆。相同克隆在医院内和医院之间的传播是MRSA广泛流行的重要原因。(5)成功构建了重组质粒pQE30-femA，并在大肠杆菌中高效表达。