犬p27基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

摘要

p27基因是一种抑癌基因,编码的蛋白是细胞周期依赖性激酶抑制因子,此蛋白调控细胞是否进入S期,在细胞周期网络中具有十分重要的作用.为进一步研究p27的生物学功能,本研究欲制备犬p27单克隆抗体.本研究采用RT-PCR方法扩增出犬p27的基因片段,并成功构建原核重组质粒pET-28a(+)-p27,将构建的重组质粒转化至BL21大肠杆菌中,顺利表达融合蛋白p27-His.SDS-PAGE电泳.结果显示,重组蛋白为可溶性表达,蛋白分子量大小为30ku.Western blotting分析结果显示,表达的重组蛋白具有良好的反应活性.纯化后的p27-His蛋白免疫6周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠,研磨小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,在PEG 4000融合剂的作用下与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选后获得共1株单克隆抗体细胞株3G8.结果本研究表达并纯化出具有良好反应原性的重组融合蛋白犬p27-His,并成功制备犬p27蛋白单克隆抗体,所获得的抗体对犬p27蛋白具有良好的反应原性和较高的特异性,为进一步研究p27的生物学特性提供研究材料.