过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞凋亡时PPARβ表达及活性变化

摘要

血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化形成的重要机制之一，过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPARs)在细胞凋亡中发挥的作用越来越受到重视。PPARs是配体活化的核转录因子，属II型核受体超家族成员之一。PPARs表达于机体多种组织中，如心血管、肝、肾、骨骼肌、脂肪组织、中枢神经系统(CNS)等。PPARs被其配体启动后调节靶基因的表达，从而影响脂质代谢及炎症反应。
　　 在PPARs三种亚型中，PPARβ在体内表达最丰富，但是对其作用知之甚少。最近研究提示PPARβ的活化可以抑制心肌细胞NF-KB的结合活性和促进内皮细胞生长。本文探讨了氧化应激诱导血管内皮细胞凋亡中PPARβ的表达和活性变化，以便为进一步研究PPARβ的活化在相关心血管疾病中的作用提供理论及实验依据。
　　 本研究以过氧化氢(H202)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡，采用流式细胞术和Caspase-3的活性检测分析内皮细胞的凋亡情况，通过Westem-blot检测PPARβ的蛋白水平，分别采用EMSA及荧光素酶报告基因检测PPARβ的DNA结合能力和转录活性。主要结果如下：①H202(0.5mmol/L)处理HUVECs后，细胞凋亡百分数在12h(p<0.05VSOh)，24h，36h(p<0.01VSOh)明显增加；Caspase-3活性检测显示12h活性升高最明显，24h有所回落，但与对照组比较仍处于较高的水平(p<0.05VSOh)。②H202(0.5mmol/L)处理HUVECs6h后，PPARβ蛋白表达下降，24h表达下降到最低(p<0.01VSOh)。③EMSA结果显示：正常的HUVECs的核蛋白与含PPARβ结合位点的探针结合后可见一条明显的探针滞留信号带（结合带），经0.5mmol/LH202处理6h，后结合带信号明显减弱，24h后进一步减弱；而同时加入200倍冷探针进行竞争可导致结合带信号消失；如果在反应体系中加入PPARβ的特异性抗体可导致结合带信号的减少，而且随着抗体的浓度增大，结合带信号减弱更加明显，采用PPARα、PPARγ抗体则对结合带无明显影响。④荧光素酶报告基因结果显示，PPARβ转录活性随H202浓度(0.25mmol/L，0.5mmol/L，1.0mmol/L)的增加而逐渐下降(p<0．01)；而且经0.5mmol/LH202处理时间越长(6h，12h，24h)PPARβ转录活性下降越明显(p<0.01)。
　　 结论：H202(0.5mmol/L)诱导HUVECs凋亡的同时伴有PPARβ表达的下调、DNA结合活性和转录活性下降。