低氧诱导胰腺癌免疫逃避机制及相关信号通路的初步研究

摘要

目的：胰腺癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，手术为其最佳治疗方法。然而，手术切除率低，对化疗药物普遍耐药，复发率高导致胰腺癌预后极差，寻找新的治疗方法成为目前研究的热点。本实验首先验证胰腺癌肿瘤内的低氧微环境及其与MIC表达的相关性，接着在体外细胞学实验中构建低氧模型并研究低氧环境中胰腺癌细胞的免疫逃逸机制。同时我们在细胞学实验中和裸鼠成瘤模型中通过直接激活NO-cGMP-PKG信号通路来研究其对低氧诱导下胰腺癌细胞逃避自然杀伤作用的逆转效果，为临床上应用激活NO-cGMP-PKG信号通路的手段促进先天性免疫系统抑制胰腺癌的发展提供理论上的依据和新的线索。
　　 方法：第一部分：收集湘雅医院2002年1月至2008年5月手术切除的胰腺癌组织标本42例，慢性胰腺炎组织标本9例，8例正常胰腺组织来自移植中心提供或尸检。免疫组织化学法检测HIF-1α和MIC在胰腺癌标本、慢性胰腺炎标本和正常胰腺标本中的表达情况，分析两者之间的相关性。第二部分：构建低氧培养模型，体外常氧及低氧条件下培养胰腺癌PANC-1细胞，免疫细胞化学法和免疫荧光细胞化学法检测细胞膜上MIC的表达，逆转录多聚酶链反应检测PANC-1细胞中MIC A和MIC B的mRNA表达变化。分选、纯化、扩增人外周血NK细胞，酶联免疫吸附法检测不同氧浓度及NO-cGMP-PKG信号通路激活或抑制时对PANC-1细胞培养基中可溶性MIC A和可溶性MIC B的表达影响，同时流式细胞仪检测PANC-1细胞膜上的MIC表达和PANC-1培养基与自然杀伤细胞共培养后NK细胞表面NKG2D的表达。MTT法检测不同靶效比时NK细胞对不同氧浓度培养及NO-cGMP-PKG信号通路激活或抑制时PANC-1细胞的杀伤活性。第三部分：PANC-1细胞裸鼠皮下成瘤，随机分成治疗组与安慰剂组，硝酸甘油为治疗药物。免疫组织化学法检测两组肿瘤标本中HIF-1α和MIC的表达。逆转录多聚酶链反应检测两组肿瘤标本中中MIC A和MIC B mRNA表达变化。蛋白印记法检测两组肿瘤标本中的MIC表达差异。酶联免疫吸附法检测两组成瘤裸鼠及正常裸鼠血清中的可溶性MIC A及可溶性MIC B差异。流式细胞仪检测两组成瘤裸鼠及正常裸鼠血液中NK细胞上NKG2D的表达差异。
　　 结果：1.免疫组化示胰腺癌组织中HIF-1α蛋白和MIC蛋白阳性率分别为为32/42(76.2％)、38/42(90.5％)，明显高于慢性胰腺炎组织2/9(22.2％)、2/9(22.2％)和正常胰腺组织0/8(0％)、1/8(12.5％)(P<0.001)。Ⅰ-Ⅱ期标本中，HIF-1α阳性表达率为57.1％，低于Ⅲ-Ⅳ期标本中的92.9％(P<0.05)。有淋巴结转移的胰腺癌组织HIF-1α蛋白阳性表达率为91.3％，高于无淋巴结转移的57.9％(P<0.05)。在不同病理分级和临床分期的标本中，MIC蛋白的表达高低也有显著差异(P<0.05)。MIC蛋白和HIF-1α蛋白表达呈负相关(r=-0.522，P<0.001)。2.经MACS免疫磁珠分选后(CD3-CD56+)NK细胞含量由分选前的13.8±2.6％提高到92.1±3.7％，IL-2扩增后满足实验要求。三气培养箱成功构建了低氧培养环境。RT-PCR示低氧组和常氧组PANC-1细胞的MIC A的mRNA水平分别为0.514±0.104、0.540±0.125，MIC B的mRNA水平分别为0.663±0.189、0.697±0.176，两组无统计学显著差异(P>0.05)。FACS示NO-cGMP-PKG信号通路激活剂会上调低氧组PANC-1细胞膜上的MIC的表达率及NK细胞的NKG2D表达率；ELISA法显示激活剂还能主要减少可溶性MICA的产生；MTT法则表明激活剂能增强PANC-1细胞对NK细胞的敏感性。抑制剂则起相反作用。3.GTN对PANC-1细胞皮下成瘤有较明显抑制作用，治疗28天后安慰剂组和治疗组的瘤体大小分别为1550.4±148.6 mm3和750.6±71.2mm3，平均抑制率达到51.59％。免疫组化显示，治疗组HIF-1α蛋白表达低于安慰剂组，MIC蛋白表达高于于安慰剂组(P<0.05)。RT-PCR和Western Blot分别定量检测瘤体中MIC基因和蛋白的水平。结果示MICA和MIC B基因在两组瘤体中均表达，治疗组瘤体中MIC A的mRNA的表达水平为0.748±0.112，MIC B的mRNA的表达水平为0.321±0.131。安慰剂组瘤体中MIC A的mRNA的表达水平为0.702±0.157，MIC B的mRNA的表达水平为0.298±0.173，两组无显著差异(P>0.05)。治疗组瘤体中MIC蛋白的表达水平为0.688±0.214，安慰剂组瘤体中MIC蛋白的表达水平为0.363±0.123，治疗组显著高于安慰剂组(P<0.01)。同时ELISA法示正常裸鼠的sMIC A和sMIC B水平分别为15.2±21.4pg/ml和0±10.2 pg/ml，治疗组sMICA和sMICB水平分别为345.1±125.2pg/ml和52.8±25.2 pg/ml，安慰剂组裸鼠血清中的sMICA和sMICB水平分别为674.2±205.4pg/ml和144.4±61.8pg/ml，治疗组低于安慰剂组，高于正常裸鼠，有显著差异(P<0.001)。FACS示正常组裸鼠血液中的NKG2D表达率为68.51±19.42％，治疗组裸鼠血液中的NKG2D的表达率为60.52±10.52％，安慰剂组裸鼠血液中的NKG2D的表达率为39.88±10.14％，正常组高于治疗组(P=0.002)，治疗组和正常组的NKG2D的表达率均高于安慰剂组(P<0.001)。NKG2D的表达率与sMIC的表达水平之间呈负相关(r=-0.905，P<0.001)。
　　 结论：胰腺癌组织中的HIF-1α表达率和表达水平显著高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织，反映胰腺癌组织中存在缺氧微环境，而HIF-1α和MIC在胰腺癌中的表达呈负相关提示低氧与肿瘤免疫逃逸有关。细胞学实验证明，其机制在于胰腺癌细胞膜上大量MIC脱落形成sMIC，sMIC封闭NK细胞上的NKG2D受体，降低NK细胞的杀伤活性。NO-cGMP-PKG信号通路与低氧诱导的胰腺癌细胞免疫逃避密切相关，抑制或激活该信号通路可增强或抑制胰腺癌细胞的免疫逃避。动物模型中GTN作为治疗药物能够减少PANC-1细胞膜上的MIC脱落，降低血清中可溶性MIC含量，提高血液中NKG2D的表达率，一定程度上抑制了胰腺癌瘤体中的免疫逃避现象并对瘤体增长有抑制效果。NO-cGMP-PKG信号通路激活剂为我们针对胰腺癌的免疫逃避机制寻找更好的免疫治疗方法提供了很好的思路。