非病毒型载体介导S0D1基因体外细胞转染及表达的实验研究

摘要

第一章 SOD1真核载体的构建及其表达
　　 目的：构建人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutasc，SOD1)基因真核表达载体，并在HeLa细胞中进行表达。
　　 方法：应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF)，采用TA克隆技术，将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定，重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后，将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，转染HeLa细胞，经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周，用Western blot检测SODl的表达。
　　 结果：成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒，转染HeLa细胞，发现转染成功的细胞均发绿色荧光；Western-blot检测结果表明，所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。
　　 结论：成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1，为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。
　　 第二章纳米羟基磷灰石表面修饰及其DAN结合性能的实验研究
　　 目的：探讨纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nHA)的表面修饰对DNA(pTracer-CMV/Bsd-SOD1)结合能力的影响。
　　 方法：采用化学共沉淀-水热合成法制备nHA；应用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)对其进行表面修饰，对修饰及未修饰纳米粒进行透射电镜观察及Zate电位检测；凝胶电泳检测纳米粒修饰前后在不同pH值、不同浓度下与DNA结合及保护DNA抗核酸酶消化的能力。
　　 结果：经PEI表面修饰的nHA透射电镜下呈短棒状，粒径较均匀，分散程度良好，而未修饰的较易团聚及分散性差；纳米粒经表面修饰后其Zeta电位为正，其在不同pH值、不同浓度下与DNA具有较强结合及抗核酸酶消化的能力；而未修饰的nHA表面带负电荷，与DNA结合及抗核酸酶消化的能力较差。在pH为7.0环境条件下经表面修饰的nHA浓度为250μg/mL时能更有效结合和保护DNA，且有较好的分散性及悬浮稳定性。
　　 结论： nHA经PEI表面修饰后可成为一种有效的DNA结合及转运载体。
　　 第三章 PEI修饰纳米羟基磷灰石载体介导SOD1基因体外细胞转染的实验研究
　　 目的：探讨经聚乙烯亚胺修饰羟基磷灰石纳米载体介导SOD1基因体外细胞转染的效果。
　　 方法：用聚乙烯亚胺修饰纳米羟基磷灰石(简称：nHA-PEI)；应用集落形成实验观察nHA-PEI及未修饰nHA颗粒对Hela细胞的细胞毒性；用nHA-PEI、nHA及脂质体介导SOD基因转染Hela并评估其转染效率；应用RT-PCR和Western-blot进一步检测nHA-PEI、nHA和脂质体介导SOD1在基因和蛋白水平的表达情况。
　　 结果：集落形成实验观察到nHA-PEI混悬液浓度为31.25～500μg/mL之间时对Hela细胞无明显抑制作用，高于500μg/mL时，显示明显的细胞毒性，而未经PEI修饰的nHA在整个实验浓度范围内均具有良好的生物相容性和无明显的细胞毒性；荧光显微下观察未经PEI修饰的nHA转染效率极低为5％～8％左右，经PEI修饰的nHA，随着PEI修饰浓度的增加，转染效率也随之增加，最高为30％左右，但仍低于脂质体约70％左右；RT-PCR和Western-blot检测结果表明，SOD1表达水平nHA-PEI转染组明显高于nHA转染组，但低于脂质体转染组
　　 结论：经适当PEI表面修饰的nHA可成为一种有效的基因转染载体，但目前转染效率低，有待进于一步研究。