二亚硝基哌嗪(DNP)上调HSP70-2在低转移潜能鼻咽癌6-10B细胞中的表达

摘要

目的：本文分析二亚硝基哌嗪(Dinitrosopiperazine，DNP)对鼻咽癌细胞热休克蛋白70-2(Heat Shock Protein70-2，HSP70-2)表达的影响，探讨DNP参与鼻咽癌转移的分子机制。
　　 方法：⑴选取来自同一母细胞的高转移潜能鼻咽癌5-8F细胞株和低转移潜能鼻咽癌6-10B细胞株作为研究材料，运用四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyltertrazolium，MTT)实验分析DNP对6-10B细胞生长的影响，筛选出DNP对6-10B细胞的非毒性浓度(non-cytotoxicconcentration，NCC)。⑵采用非毒性浓度的DNP处理6-10B细胞，并以未处理的6-10B细胞、5-8F细胞作为对照，进行细胞生物学和分子生物学实验。⑶采用细胞间接免疫荧光方法初步分析DNP对HSP70-2表达的影响，Western Blotting分析DNP诱导HSP70-2表达的量效关系。⑷采用Real-time RT PCR技术检测DNP对HSP70-2基因表达的影响。⑸利用SPSS18.0统计软件分析数据。
　　 结果：①MTT实验分析DNP对鼻咽癌6-10B细胞生长的影响，结果表明DNP在高浓度(100μmol/L以上)时对鼻咽癌6-10B细胞生长增殖有明显的抑制作用(p<0.05)，而在0～100μmol/L时对6-10B细胞的生长没有明显影响(p>0.05)。0～100μmol/L为DNP对6-10B细胞的非毒性浓度。②细胞间接免疫荧光实验观察DNP对鼻咽癌细胞HSP70-2表达的影响，结果显示DNP处理鼻咽癌6-10B细胞后，HSP70-2蛋白表达明显增强，细胞中的表达以胞浆为主，且DNP处理的6-10B细胞荧光强度同高转移潜能5-8F细胞一致。③Western Blotting分析DNP诱导HSP70-2表达的量效关系，结果显示不同浓度(50pmol/L、100μmol/L)DNP处理的6-10B细胞，HSP70-2蛋白水平明显高于未处理6-10B细胞，且随DNP量增加而HSP70-2逐步增高(P<0.05)。④Real-time PCR分析DNP对Hsp70-2基因表达的影响，结果显示，未处理6-10B细胞中Hsp70-2基因相对折合表达量(1.04±0.33)与不同浓度(50μmol/L、100μmol/L)DNP处理的6-10B细胞中Hsp70-2基因相对折合表达量(分别为0.81±0.14、0.81±0.26)无明显差异(P>0.05)，但5.8F细胞中的表达量(1.84±0.79)高于6-10B细胞。
　　 结论：⑴DNP处理6-10B细胞后，细胞中的HSP70-2蛋白水平明显增高，表明DNP能上调HSP70-2蛋白水平。⑵DNP处理6-10B细胞后，细胞中的Hsp70-2基因的相对折合表达量并不增高，DNP可能不是在基因水平调控HSP70-2，提示DNP可能通过转录后调控机制上调HSP70-2蛋白表达。⑶5-8F细胞中的HSP70-2蛋白水平高于6-10B细胞，提示HSP70-2可能与细胞的恶性程度(转移潜能)有关。