抑制神经酰胺合成对糖尿病大鼠内皮功能紊乱及动脉粥样硬化形成的影响

摘要

目的：
　　 研究旨在明确：①糖尿病大鼠血管神经酰胺含量是否增加。②糖尿病大鼠血管神经酰胺含量与内皮依赖性血管舒张功能的关系。③糖尿病大鼠血管内皮细胞功能与结构的变化是否与血管神经酰胺积聚抑制内皮细胞PI3K/PKB/eNOS信号通路有关。④神经酰胺合成抑制剂通过减少神经酰胺合成能否改善糖尿病大鼠主动脉内皮细胞形态及内皮依赖性血管舒张功能，并减少动脉粥样硬化斑块的形成。
　　 方法：
　　 将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成正常对照组(NCgroup)(n=15)和糖尿病模型组(DM)(n=45)。高糖高脂饲料(10％炼猪油，2.5％胆固醇，20％蔗糖，1％胆酸盐，66.5％普通饲料)喂养糖尿病模型组SD大鼠，4周过后用小剂量链脲佐菌素(STZ)-30mg/Kg腹腔注射破坏部分胰岛β细胞，诱导建立2型糖尿病模型。模型成功后将其随机分为DM对照组(DMC group)，myriocin干预的DM组(MTD group)。Myriocin干预的DM组予myriocin0.3mg/kgQod腹腔注射，DM对照组及正常对照组予以等量溶媒腹腔注射。两组糖尿病大鼠继续喂以高糖高脂饲料，正常对照组继续喂以普通饲料。所有大鼠在myriocin干预12周后麻醉处死。各组大鼠均留取空腹全血用于糖化血红蛋白(HbAlc)、胰岛素、血清神经酰胺、肝功能、血脂的检测。立即分离胸主动脉并分段，分别用于内皮依赖性血管舒张功能测定、血管神经酰胺测定、电镜下内皮结构观察、HE染色后动脉粥样硬化斑块观察、信号分子PI3K/PKB/eNOS的RT-PCR、Western-blot检测，以及内皮细胞eNOS免疫组化测定。
　　 结果：
　　 1.高糖高脂喂养SD大鼠4周后联合小剂量链脲佐菌素30mg/Kg可成功的诱导出T2DM大鼠模型，所有成模大鼠多次FBS(空腹血糖)≥7.0mmol/L和/或PBS(餐后血糖)≥11.1mmol/L。与正常对照组比较，DM对照组胰岛素水平显著升高(P<0.05)，而myriocin干预的DM组胰岛素水平较DM对照组明显下降(P<0.05)；与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组胰岛素抵抗指数增高有统计学意义(P<0.05)，DM对照组较myriocin干预的DM组高(P<0.05)。
　　 2.与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组麻醉处死前FBS，PBS增高都有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组下降(P<0.05)。
　　 3.与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组糖化血红蛋白增高都有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组下降(P<0.05)。与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组肝功能损害严重(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组损害较轻(P<0.05)。与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组血脂增高都有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组降低(P<0.05)。与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组肝脏湿重明显增高(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组降低(P<0.05)。
　　 4.与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组血清神经酰胺增高有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组下降(P<0.05)。与正常对照组比较，DM对照组血管神经酰胺增高有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组血管神经酰胺下降有统计学意义(P<0.05)。
　　 5.与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组血清及血管NO含量下降有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组升高(P<0.05)。
　　 6.与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组EDVD(内皮依赖性血管舒张功能)下降有统计学意义(P<0.05)，但myriocin干预的DM组较DM对照组升高(P<0.05)。
　　 7.与正常对照组比较，DM对照组与myriocin干预的DM组主动脉内皮下有明显脂质沉积，在DM对照组可见明显动脉粥样硬化斑块形成，但myriocin干预的DM组无明显动脉粥样硬化斑块，且内皮下脂质沉积较DM对照组明显减少(P<0.05)。
　　 8.与正常对照组比较，DM对照组内皮层结构不完整，内皮细胞胞浆水肿，部分内皮细胞坏死、脱落，myriocin干预的DM组较DM对照组内皮细胞病变明显减轻，且内皮层结构完整。
　　 9.与正常对照组比较，DM对照组血管eNOS mRNA、eNOS蛋白、磷酸化eNOS-Ser1177、磷酸化PKB-Ser473及磷酸化PI3K-P85表达明显下降(P<0.05)，myriocin干预的DM组较DM对照组上述指标表达明显增高(P<0.05)。AKT mRNA、PI3K-P85 mRNA及AKT蛋白表达在3组中无显著差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.2型糖尿病大鼠模型血清及血管组织中神经酰胺明显积聚，血管内皮细胞PI3K/PKB/eNOS通路活性下降，NO产生减少，内皮依赖性血管舒张功能下降，内皮细胞结构紊乱，内皮下脂质沉积严重，有动脉粥样硬化斑块形成。
　　 2.用神经酰胺基础合成途径抑制剂myriocin抑制2型糖尿病大鼠模型血清及血管组织中神经酰胺积聚，改善了糖尿病大鼠胰岛素抵抗与肝功能，降低了血糖与血脂水平。
　　 3.应用神经酰胺基础合成途径抑制剂myriocin干预糖尿病大鼠使血管组织神经酰胺积聚下降，使血管内皮细胞PI3K/PKB/eNOS通路活性明显改善，NO产生增加，内皮依赖性血管舒张功能改善，内皮细胞结构紊乱明显改善，内皮下脂质沉积明显减轻，无明显动脉粥样硬化斑块形成。
　　 4.糖尿病大鼠血管内皮细胞结构功能紊乱及动脉粥样硬化斑块形成与组织内神经酰胺积聚有关，神经酰胺可以直接和/或间接抑制内皮细胞胰岛素信号通路PI3K/PKB/eNOS的活性而导致内皮细胞功能紊乱，促进动脉粥样硬化斑块形成。抑制糖尿病大鼠血管组织神经酰胺合成可能成为糖尿病血管病变治疗的新靶点。