丙酸睾酮治疗小鼠自身免疫性卵巢早衰及其机制的研究

摘要

第一章自身免疫性卵巢早衰动物模型的建立及其胸腺、卵巢组织Foxp3的表达。
　　 目的：建立并评估自身免疫性卵巢早衰小鼠动物模型，初步了解其卵巢及胸腺组织中Foxp3的表达情况。
　　 方法：将30只C57BL/6近交系雌性小鼠随机分为POF模型组、佐剂对照组及空白对照组，每组10只。参照付莉等人报道的方法建立自身免疫性POF小鼠模型：模型组小鼠双侧后脚掌掌心处皮下注射CFA-pZP3(完全弗氏佐剂-小鼠透明带3多肽)混合液0.1ml(每侧0.05ml)；佐剂对照组同法注射CFA-三蒸水混合液0.1ml；空白对照组同法注射三蒸水0.1ml。取阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化；免疫后第14天取外周血并处死小鼠，取卵巢及胸腺组织待测。ELISA法测定各组小鼠外周血清抗透明带抗体浓度；HE染色观察各组小鼠卵巢生长卵泡比例；免疫组织化学法检测各组小鼠卵巢CD45的表达了解自身免疫性卵巢炎的发生情况。建模成功后采用免疫组织化学法检测各组小鼠卵巢及胸腺组织中Foxp3的表达情况。
　　 结果：
　　 1、POF模型组小鼠经皮下注射后性周期紊乱率、外周血清抗透明带抗体平均浓度及自身免疫性卵巢炎发生率均明显高于佐剂对照组及空白对照组(P<0.01)；POF模型组小鼠卵巢生长卵泡比例明显低于佐剂对照组及空白对照组(P<0.01)。佐剂对照组与空白对照组小鼠上述指标均无统计学差异(P>0.05)。
　　 2、POF模型组小鼠胸腺、卵巢Foxp3免疫组化平均积分及阳性表达率均明显低于佐剂对照组及空白对照组(P<0.05)；佐剂对照组与空白对照组小鼠胸腺、卵巢Foxp3免疫组化积分及阳性表达率均无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1、小鼠透明带3片段可以成功诱导自身免疫性卵巢早衰动物模型；
　　 2、自身免疫性卵巢早衰小鼠胸腺及卵巢组织中Foxp3的表达均明显下降。
　　 第二章不同浓度丙酸睾酮对小鼠自身免疫性卵巢早衰的治疗作用。
　　 目的：探讨不同浓度丙酸睾酮对小鼠自身免疫性卵巢早衰的治疗作用。
　　 方法：将50只C57BL/6近交系雌性小鼠随机分为低、中、高剂量丙酸睾酮治疗组，糖皮质激素治疗组及模型对照组，每组10只。各组小鼠均按第一部分方法建立POF模型；于免疫后第14天开始各丙酸睾酮治疗组小鼠每天分别腹腔注射丙酸睾酮注射液0.02mg，0.1mg，0.5mg，糖皮质激素治疗组每天腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液0.2mg，模型对照组每天腹腔注射生理盐水0.1ml，均持续2周。取阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化；ELISA法测定各组小鼠外周血清抗透明带抗体浓度；HE染色观察各组小鼠卵巢生长卵泡比例；免疫组织化学法检测各组小鼠卵巢CD45的表达了解自身免疫性卵巢炎的发生情况。
　　 结果：中剂量丙酸睾酮治疗组及糖皮质激素治疗组性周期紊乱率、血清抗透明带浓度及自身免疫性卵巢炎发生率明显低于模型对照组(P<0.05)，生长卵泡比例明显高于模型对照组(P<0.05)；低、高剂量治疗组性周期紊乱率、血清抗透明带浓度明显高于中剂量治疗组(P<0.05)，生长卵泡比例明显低于中剂量治疗组(P<0.05)；中剂量丙酸睾酮治疗组与糖皮质激素治疗组间上述各指标均无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：中剂量丙酸睾酮可以改善小鼠自身免疫性卵巢早衰。
　　 第三章丙酸睾酮治疗小鼠自身免疫性卵巢早衰的机制。
　　 目的：从AR及Foxp3的表达情况探讨丙酸睾酮治疗小鼠自身免疫性卵巢早衰的机制。
　　 方法：将40只C57BL/6近交系雌性小鼠随机分为丙酸睾酮治疗组，拮抗剂氟他胺治疗组，拮抗剂氟他胺+丙酸睾酮治疗组和模型对照组，每组10只。各组小鼠均按第一部分方法建立POF模型；于免疫后第14天开始各组小鼠每天分别腹腔注射丙酸睾酮注射液0.1mg，氟他胺0.5mg，丙酸睾酮注射液0.1mg+氟他胺0.5mg；模型对照组及空白对照组每天腹腔注射生理盐水0.1ml，均持续2周。取阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化；ELISA法测定各组小鼠外周血清抗透明带抗体浓度；HE染色观察各组小鼠卵巢生长卵泡比例；免疫组织化学法检测各组小鼠卵巢CD45的表达了解自身免疫性卵巢炎的发生情况；免疫组织化学法检测各组小鼠胸腺AR、Foxp3及卵巢Foxp3的表达情况；Western-Blot法检测各组小鼠胸腺AR、Foxp3蛋白的表达情况；Real-time PCR法检测各组小鼠胸腺AR、Foxp3mRNA的转录情况。
　　 结果：
　　 1、丙酸睾酮治疗组小鼠性周期紊乱率、血清抗透明带浓度及自身免疫性卵巢炎发生率明显低于模型对照组(P<0.05)，生长卵泡比例明显高于模型对照组(P<0.05)；氟他胺治疗组、丙酸睾酮+氟他胺治疗组小鼠性周期紊乱率、血清抗透明带浓度及自身免疫性卵巢炎发生率明显高于丙酸睾酮治疗组(P<0.05)，生长卵泡比例明显低于丙酸睾酮治疗组(P<0.05)；氟他胺治疗组及丙酸睾酮+氟他胺与模型对照组比较上述指标均无统计学差异(P>0.05)。
　　 2、丙酸睾酮治疗组小鼠胸腺AR蛋白相对表达量、mRNA的表达量均明显高于模型对照组(P<0.05)；氟他胺治疗组及丙酸睾酮+氟他胺AR mRNA表达量明显低于丙酸睾酮治疗组(P<0.05)；氟他胺治疗组及丙酸睾酮+氟他胺与模型对照组比较上述指标均无统计学差异(P>0.05)；各组间AR阳性表达率及免疫组化积分无统计学差异(P>0.05)。
　　 3、丙酸睾酮治疗组小鼠胸腺Foxp3阳性表达率、免疫组化积分、蛋白相对表达量、mRNA的表达量均明显高于模型对照组(P<0.05)；丙酸睾酮+氟他胺及氟他胺治疗组上述指标均明显低于丙酸睾酮治疗组(P<0.05)；氟他胺治疗组及丙酸睾酮+氟他胺与模型对照组比较上述指标均无统计学差异(P>0.05)。
　　 4、丙酸睾酮治疗组小鼠卵巢Foxp3阳性表达率、免疫组化积分均明显高于模型对照组(P<0.05)；丙酸睾酮+氟他胺及氟他胺治疗组上述指标均明显低于丙酸睾酮治疗组(P<0.05)；氟他胺治疗组及丙酸睾酮+氟他胺与模型对照组比较上述指标均无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：丙酸睾酮可能通过上调AR及Foxp3的表达改善小鼠自身免疫性卵巢早衰。