TGF-β1对大鼠肝星状细胞端粒酶逆转录酶表达的影响

摘要

目的：分离纯化大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)并进行体外培养，研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)对大鼠肝星状细胞端粒酶逆转酶表达的影响，探讨转化生长因子β1在肝纤维化中的作用及其机制。
　　 方法：采用链霉蛋白酶E、IV型胶原酶原位灌注和振荡消化离体的大鼠肝脏；分别以Percoll液和Nycodenz液的非连续密度梯度离心分离纯化HSCs；细胞计数板法计算细胞得率；台盼蓝染色法显示细胞存活率；Desmin鉴定细胞纯度。首先，MTT比色法检测TGF-β1对HSCs增殖的影响。然后按照下述方法进行实验。方法一：将原代分离的HSCs细胞分为三组：(1)TGF-β1处理3天组以及对照组；(2)TGF-β1处理6天组以及对照组；(3)TGF-β1处理9天组以及对照组，半定量反转录一聚合酶链式法(RT-PCR)检测各组TERT mRNA的表达。方法二：原代分离的HSCs细胞培养6天后，将HSCs分为四组，分别加入不同浓度的TGF-β1：(1)0ng/ml TGF-β1组；(2)0.1ng/mlTGF-β1组；(3)1ng/ml TGF-β1组；(4)10ng/ml TGF-β1组，24小时后，半定量RT-PCR检测各组TERT mRNA的表达。
　　 结果：
　　 1.采用Percoll液和Nycodenz液体外分离纯化大鼠肝HSCs，Nycodenz液体外分离纯化法分别在细胞得率，还是在细胞存活率、细胞纯度方面均优于前者。本研究建立一种简便、高效的大鼠肝星状细胞分离方法。新分离的细胞培养3个小时后在荧光显微镜328nm波长的紫外光激发下，可观察到极容易淬灭的蓝色的自发荧光；免疫细胞化学染色显示所培养的细胞Desmin蛋白与α-SMA(α-smoothmuscle actin)阳性，证实所培养的细胞是HSCs。分离培养的大鼠原代HSCs活率在90％以上，纯度超过90％。
　　 2.TGF-β1在(1-20)ng/ml浓度范围内，对原代培养6天的HSCs分别作用12小时、24小时后，随着TGF-β1浓度的增加，OD值没有明显的变化，其差别没有统计学意义。
　　 3.随着时间的延长，原代培养的HSCs端粒酶逆转酶的活性有增强的趋势。
　　 4.1ng/ml TGF-β1对原代HSCs作用3天后，TERT与内参照β-actin的灰度值比值，处理组与正常对照组相比，其差别没有统计学意义；1ng/ml TGF-β1对原代HSCs作用6天后，TERT与内参照β-actin的灰度值比值，处理组与正常对照组相比，其差别具有统计学意义(P<0.05)；1ng/ml TGF-β1对原代HSCs作用9天后，细胞几乎全部凋亡，无法与对照组相比较。
　　 5.0.1ng/ml TGF-β1作用原代HSCs24小时后，TERT与内参照β-actin的灰度值比值，处理组与正常对照组相比，其差别没有统计学意义；1ng/ml与10ng/ml TGF-β1分别作用原代HSCs24小时后，TERT与内参照β-actin的灰度值比值，处理组与正常对照组相比，其差别具有统计学意义(P<0.01)。
　　 结论：TGF-β1在一定的浓度与时间范围内，一方面能促进原代HSCs的活化，另一方面能抑制原代HSCs端粒酶逆转酶的表达，作用呈现时间剂量依赖性。这提示TGF-β1对体外肝星状细胞自行激活为肌成纤维细胞的过程可能起着重要的作用。