外源性TGF-β3对大鼠肝星状细胞内源性TGF-β3表达及其增殖的影响

摘要

目的：转化生长因子-β（transforming growth factor，TGF-β）是一种多功能的多肽类细胞因子超家族，几乎体内所有细胞都能分泌TGF-β并存在其受体，在细胞的生长调节中起重要作用。TGF-βl是最重要的致纤维化因子，而TGF-β3则有拮抗TGF-βl的作用。研究发现TGF-β3在肝脏中具有抗肝纤维化功能。为了促进机体内内源性TGF-β3的大量表达，本实验应用外源性重组细胞因子TGF-β3干预大鼠肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC），通过检测HSC中TGF-β3mRNA、蛋白的表达水平及HSC的增殖，探讨外源性TGF-β3对HSC分泌内源性TGF-β3及HSC增殖的影响。
　　 方法：体外培养HSC，加入外源性TGF-β3（10ng/ml）培养的细胞为TGF-β3组，未加入外源性TGF-β3培养的细胞为对照组，（1）分别在1h、2h、4h、12h和24h收集细胞，应用实时荧光定量PCR法检测内源性TGF-β3 mRNA表达；（2）分别在0h、1h、6h和12h收集细胞，应用western-blot法检测细胞内TGF-β3蛋白的表达；（3）分别在0h、2h、4h、8h、14h和24h收集细胞，应用ELISA法检测细胞外总TGF-β3蛋白的表达；加入外源性TGF-β3培养HSC 2h，然后换用无TGF-β3的DMEM培养基继续培养细胞至2.25h、2.5h、3h、4h、6h、10h和14h收集细胞上清液，应用ELISA法检测细胞外内源性TGF-β3蛋白的表达。（4）外源性TGF-β3对HSC增殖的影响：将HSC接种于96孔板，培养6h后，分为A、B两组，A组用不同浓度的外源性TGF-β3干预HSC，24h后用MTT法检测细胞增殖情况，B组用5ng/ml外源性TGF-β3干预HSC，在24h和48h时用MTT法检测细胞增殖情况；（5）细胞形态分析：倒置显微镜下观察对照组和外源性TGF-β3干预组的HSC大体形态。
　　 结果：（1）加入外源性TGF-β3干预HSC后，细胞内TGF-β3mRNA表达水平明显增高，于2h达峰值（3.756±0.667：1.207±0.129），为对照组的3.11倍（P<0.05），随后缓慢降低，维持在1.56倍水平达10h之久，24h时(1.375±0.131：1.066±0.085)表达水平仍为对照组的1.30倍（P＜0.05）；（2）不同时间点细胞内TGF-β3表达水平无显著变化（P>0.05）；（3）细胞外总TGF-β3含量明显增加，于4h时达高峰（18.931±2.904：10.026±0.022ng/ml），约为干预量的1.89倍，随后开始下降；内源性TGF-β3于干预后3h达高峰(0.835±0.027：0.026±0.022ng/ml)，为对照组的32.36倍，之后开始逐渐降低，直至维持一个弱增长的表达状态（P<0.05）。（4）低浓度的外源性TGF-β3（0.001-0.08ng/ml）不影响HSC的增殖，从0.32ng/ml开始，外源性TGF-β3可促进HSC的增殖，HSC的增殖与外源性TGF-β3无剂量依赖关系（P＞0.05）；（5）镜下观察HSC，TGF-β3干预组细胞形态与空白对照组相比无明显差异。
　　 结论：（1）外源性TGF-β3可促进HSC分泌大量内源性TGF-β3；（2）TGF-β3可促进HSC的增殖；（3）外源性TGF-β3的干预对HSC细胞大体形态无明显影响。

目录

文摘

英文文摘

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前 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

综述;相关蛋白酶在转化生长因子-β激活中的作用

附录1（攻读学位期间发表论文目录）

致 谢