c-Met基因表达与胃癌细胞MKN-45对EGFR-TKI敏感性的研究

摘要

背景和目的：胃癌是EGFR过表达的肿瘤，但目前研究显示胃癌对EGFR-TKI不敏感，可能存在酪氨酸激酶抑制剂的原发耐药。在非小细胞肺癌中非靶受体c-Met继发性过表达与吉非替尼的继发性耐药有关。c-Met过表达在胃癌中较为常见，目前有研究发现肝细胞生长因子拮抗剂NK4可以提高吉非替尼在胃癌细胞中的敏感性。提示c-Met的异常表达可能影响了胃癌对EGFR-TKIs的敏感性。本研究以EGFR与c-Met过表达且无EGFR突变的胃癌细胞株MKN-45为研究对象，探索能否通过改变胃癌细胞的c-Met基因表达状态来改变其对吉非替尼的敏感性，本研究结果可为是否采用吉非替尼与c-Met抑制剂联合治疗胃癌提供依据。
　　 材料与方法：1、人胃癌细胞MKN-45获赠于中南大学湘雅医学院病理实验室，置于37℃、5％C02、湿度为80％的培养箱中用含有10％胎牛血清的DMEM（高糖）完全培养基培养。从Genebank基因数据库获得c-Met基因序列，设计3条c-Me t-si RNA序列，委托上海吉玛制药技术有限公司采用化学合成法合成。2、通过脂质体LipofectaminTM2000介导，将3条c-Met-siRNA序列转入人胃癌细胞MKN-45中，并设置阴性对照组、LipofectaminTM2000组和空白对照组。3、转染48h后，利用适时定量PCR(real time-PCR，RT-PCR)方法检测转染前后胃癌MKN-45细胞c-Met基因mRNA的变化;利用Western-Blot方法检测转染前后胃癌MKN-45细胞c-Met蛋白的变化;利用AnnexinV和PI双染流式检测RNA干扰对细胞凋亡的影响。利用MTT法检测胃癌细胞MKN-45对吉非替尼的IC50。4、采用SPSS19.0统计软件包对数据进行分析，各组数据用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较利用单因素ANONA分析，以P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果：1、转染48h后， RT-PCR和Western-Blot方法检测转染后胃癌细胞MKN-45 c-Met基因的mRNA和蛋白表达较三个对照组均明显下降(P＜0.05)。2、转染后胃癌细胞MKN-45凋亡率明显增加（P＜0.05)。3、转染后胃癌细胞MKN-45对吉非替尼的IC50未明显降低（P＞0.05）。
　　 结论：1、利用RNA干扰技术可成功下调胃癌MKN-45细胞中的c-Met基因的表达。2、胃癌细胞MKN-45转染c-Met-siRNA成功后可促进细胞凋亡。3、沉默c-Met基因未能改善胃癌细胞MKN-45对吉非替尼的敏感性。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

第一章 前言

第二章 材料和方法

1、实验材料

1．1 实验细胞

1．2 主要试剂及配制方法

1．3 实验器材

2．实验方法

2．1 细胞培养

2．2 siRNA转染

2．3 Western-Blot检测c-Met蛋白的表达情况

2．4 RT-PCR检测c-Met mRNA的表达情况

2．5 流式细胞仪检测细胞凋亡

2．6 MTT法检测吉非替尼对胃癌细胞MKN-45的IC50

2．7 统计学分析

第三章 实验结果

第四章 讨论

1、EGFR与胃癌

1．1 EGFR在胃癌中的表达及其意义

1．2 EGFR-TKI在胃癌中的应用

1．3 EGFR-TKI与c-Met

2、c-Met与胃癌

2．1 c-Met在胃癌中的表达及意义

2．2 c-Met沉默与胃癌对EGFR-TKI的敏感性

第五章 结论

参考文献

基因检测报告

综述

致谢