mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法

摘要

一种mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，本方法比较了mPRα对不同EGFR突变状态的肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的影响，通过诱导肺腺癌敏感株PC-9细胞成为耐药株PC-9GR细胞，动态观察耐药过程与mPRα表达的关系。本发明的mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，从女性激素的角度探讨孕酮经膜受体介导是否可以改善不同EGFR突变表型的肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性，拟为未来研究肺腺癌靶向药物增敏剂提供理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及性激素及受体与肺腺癌关系研究领域，特别涉及mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法。

背景技术

近年来，女性激素及其受体在肺腺癌的发生、发展与治疗中的作用成为人们研究的热点。有学者认为肺腺癌像乳腺癌和子宫内膜癌等一样也属于性激素依赖性肿瘤。女性激素包括雌激素(Estrogen)和孕激素(孕酮，Progesterone，P4)，雌激素的促癌作用已达成广泛共识，而孕激素对肺癌的作用与雌激素似乎不同。Ishibashi等在孕激素受体表达阳性的小鼠肺癌模型中，发现用孕酮处理可以抑制肿瘤生长。与之相反的是，Check等的研究结果却表明米非司酮(孕激素核受体抑制剂)能延缓小鼠自发肺部肿瘤的进展。此外，在孕酮对乳腺癌影响的研究中也发现类似矛盾的肿瘤生物学现象。现在认为这种矛盾现象可能与实验对象的孕激素受体不同或其表达状态不同有关，这激起研究者们对孕激素及其受体在肿瘤中作用机制探索的兴趣。

孕激素可与孕激素受体(ProgesteroneReceptor，PR)结合激活下游的分子信号通路而发挥作用。孕激素的经典作用途径由孕激素核受体(nuclearprogesteronereceptor,nPR)介导，依赖于目的基因的转录和翻译，调控靶基因的表达水平而对细胞的各种功能产生调控作用，称之为基因组作用。另外，孕酮还可对缺乏孕激素核受体的细胞和组织发挥作用，如T淋巴细胞、血小板、大鼠黄体细胞等，这种作用并不依赖于孕激素核受体的基因转录，故命名为非基因组作用。在这类细胞中，强有力的nPR激动剂(如R5020)或nPR拮抗剂(如米非司酮)对孕酮的快速非基因组作用很少或根本没有影响。这些证据均提示除了孕激素核受体之外，还有可能存在其他类型的孕激素受体。

2003年Zhu等首次从云纹犬牙石首鱼卵巢组织中克隆出了孕激素膜受体(MembraneProgesteroneReceptors，mPRs)的cDNA，认为其编码的蛋白质满足类固醇激素受体的七条标准，即结构合理性、亚细胞定位、组织分布具有特异性、可与孕激素特异性结合、具有激素调节作用、信号转导功能和生物学相关性。到目前为止，已发现的mPRs亚型有五种，即mPRα、mPRβ、mPRγ、mPRδ、mPRε，其中mPRα(MembraneProgesteroneReceptorα)是新发现的，研究较多的，且作用最强的孕激素膜受体，因而受到广泛关注。后来对其结构研究发现，mPRα基因编码的mRNA长度为4.0kb，其表达的蛋白质分子大小为40kD。mPRα蛋白具有7次跨膜区域，包含细胞内的羧基端(C-端)和细胞外的氨基端(N-端)，与G蛋白耦联受体(GproteinCoupledReceptor，GPCR)具有相似性，属于一种独特的受体家族，叫做孕激素和脂联素Q受体家族(Progestinandadiponectinreceptor，PAQR)。2007年Dressing等利用PCR和Western-blot技术在乳腺癌MCF-7和SKBR-3细胞中检测到有mPRαmRNA和蛋白质表达。我们课题组前期研究发现mPRα在肺腺癌细胞和组织中均有表达，其可介导孕酮(P4)抑制肺腺癌细胞A549的增殖与侵袭。2010年Zuo等在乳腺癌细胞的研究中发现mPRα与小窝蛋白-1(Cav-1)和表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)共同定位于细胞膜表面的小窝囊泡结构，并证明mPRα介导孕酮可经PI3K/Akt和EGFR信号通路逆转乳腺癌细胞的上皮间质转化(EMT)。此外，多项研究表明，孕酮可通过非基因组作用快速启动多种细胞活动，其中一部分是通过EGFR信号通路完成，进而对细胞的多种生物学效应进行调控，包括激素分泌、小分子物质摄入、离子通道激活以及胞质内酶的活化(如MAPK、PKA)等。这些研究均提示孕激素膜受体信号通路与EGFR信号通路存在交联。

EGFR信号通路是目前肺癌研究中最为广泛的一个领域。人们发现EGFR基因突变或扩增导致EGFR信号通路的持续活化与NSCLC的发生、进展和预后相关。EGFR活化突变主要位于酪氨酸激酶区域，常见的突变类型有18外显子(如G719X)、19外显子(如LREA缺失)、20外显子、21外显子(如L858R)突变。在肺癌患者中，约20％的患者存在EGFR突变，而这一比例在肺腺癌(40％)、女性患者(42％)、亚裔(30％)和不吸烟(51％)患者中明显增加。EGFR基因突变的发现使以EGFR为目标分子的靶向治疗成为晚期NSCLC治疗的里程碑，其中EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是目前临床应用最普遍的一类靶向治疗药物，常用的药物有吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(特罗凯/OSI-774)、埃克替尼等。然而，肺癌对EGFR-TKIs的敏感性主要取决于EGFR的突变状态，EGFR野生型患者对EGFR-TKIs的敏感性较差，故指南推荐对存在EGFR活化突变的肺癌患者优先考虑使用EGFR-TKIs。

在EGFR突变型患者中，EGFR-TKIs治疗后RR(缓解率)可达到75％，这就意味着大约25％的患者不能从EGFR-TKIs治疗中获益即发生了耐药。此外，人们发现，几乎所有对EGFR-TKIs非常敏感的肺癌患者在治疗8-16个月后不可避免的发生了耐药。EGFR-TKIs耐药分为原发性耐药和获得性耐药。目前研究发现原发性耐药可能的机制有：20外显子插入或复制突变(如D770-N771、insNPG、insSVQ、insG、N771T突变)；罕见突变(如E709A突变)；与EGFR突变并存的其他基因组突变(如PIK3CA突变、IGF1R突变)；EGFR野生型(如：ALK融合基因突变、KRAS突变、BRAF突变)等。获得性耐药的可能机制有：二次突变(如T790M、L747S、D761Y、T854A突变)；MET基因扩增等。针对EGFR-TKIs的耐药情况，各国科研工作者经过不懈努力提出了一些应对之策，包括二、三代EGFR-TKIs的研发、多条信号通路阻断剂的联合应用、其他驱动突变基因阻断剂(如克唑替尼)等。然而，对EGFR-TKIs耐药的研究现在仍处于起步阶段，许多问题亟待解决，因此，改善EGFR-TKIs的敏感性、逆转其耐药性以及寻找新的针对EGFR野生型肺腺癌的治疗靶点成为肺癌治疗的新兴主题之一。

随着对女性肺癌特点的深入研究，多项临床研究发现亚裔女性肺腺癌患者更容易发生EGFR基因突变，且对EGFR-TKIs治疗的敏感性相对较高，推测女性激素及其受体可能与EGFR突变及EGFR-TKIs靶向治疗相关。最近有研究证明，SRC抑制剂通过介导ERK(ExtracellularRegulatedKinase)再活化可恢复肺腺癌耐药株PC-9GR细胞对EGFR-TKIs的敏感性。而之前已有研究证明在人子宫平滑肌细胞中，mPRα可介导孕酮抑制SRC的表达。然而，目前mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性本领域尚无相关研究。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，从女性激素的角度探讨孕酮经膜受体介导是否可以改善不同EGFR突变表型的肺腺癌细胞(EGFR野生型A549细胞、EGFR突变型PC-9细胞、EGFR耐药突变型PC-9GR细胞)对EGFR-TKIs的敏感性，拟为未来研究肺腺癌靶向药物增敏剂提供理论基础。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，通过比较mPRα对不同EGFR突变状态的肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的影响，诱导肺腺癌敏感株PC-9细胞成为耐药株PC-9GR细胞，从而动态观察耐药过程与mPRα表达的关系。

进一步的，mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，包括如下步骤：

步骤一：细胞培养

(1)冻存细胞复苏

将冻存的细胞迅速放入提前调好温度的37℃恒温水浴箱，轻轻摇晃冻存管，使细胞尽快融化；待细胞悬液完全融化后，喷洒75％的酒精消毒，放入已用紫外灯照射消毒好的生物安全柜中，用巴氏吸管将冻存管内细胞混悬液转移至无菌的15ml离心管中；加入5ml提前配制好的完全培养基，混匀，常温离心机800rpm，离心5min；弃上清液，加入5ml完全培养基混匀，转入无菌培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的细胞恒温培养箱中进行培养；

(2)细胞换液

从细胞恒温培养箱中取出细胞培养瓶，荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态，喷洒酒精消毒后放入生物安全柜中；倒掉培养瓶中旧的培养基，无菌PBS溶液轻轻冲洗3次，加入5ml新鲜的完全培养基，置于37℃，5％CO₂的细胞恒温培养箱中进行培养；

(3)细胞培养传代

从细胞恒温培养箱中取出细胞培养瓶，荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态，如果细胞生长密度达80-90％则可以传代；喷洒酒精消毒后放入生物安全柜中，倒掉培养瓶中旧的培养基，无菌PBS溶液轻轻冲洗3次，加入1ml0.05％的胰蛋白酶液，置于恒温培养箱中消化3-5min，若荧光倒置显微镜下观察细胞的形态已收缩变圆形，可加入约3ml的完全培养基终止细胞消化过程；巴氏吸管轻轻吹打使细胞分散成单个，将细胞悬液平均分配到2个新的培养瓶中，每个培养瓶加入完全培养基至5ml，标记好细胞种类、传代日期和细胞代数，置于37℃，5％CO₂的细胞恒温培养箱中进行培养；

(4)细胞冻存

在细胞冻存前24h需换液一次，取生长状态良好，处于对数期分裂细胞进行冻存；将细胞从培养瓶底部消化下来；配制细胞冻存液，胎牛血清：DMSO＝9:1；用冻存液重悬细胞，并用巴氏吸管轻轻吹打细胞使之混匀，转移至冻存管中，进行梯度降温，-4℃冰箱放置20min，-20℃冰箱放置20min，-80℃冰箱暂时保存，1周内转移至液氮罐中可长期保存，注意标记好细胞种类、冻存日期和细胞代数；

步骤二：基因测序法检测EGFR突变状态

(1)DNA提取：按照DNA提取试剂盒protocol进行操作；

1)准备工作：①向裂解液RL-plus中加入一定量的β-巯基乙醇使其终浓度为1％；②按试剂瓶上标注向漂洗液PW、缓冲液GD加入适量无水乙醇；③用RNase-FreeddH2O配制70％的无水乙醇；

2)收集细胞，数量<1x107个，PBS溶液洗涤细胞，吸出PBS溶液，向细胞中加入含有0.05％胰蛋白酶消化细胞，当细胞脱离瓶底时，加入完全培养基终止消化，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，800rpm离心10min，收集管中细胞沉淀，仔细吸弃所有上清液；

3)裂解处理：对于离心后得到的细胞沉淀，手指轻弹离心管底部，使细胞沉淀变松散，加入约600μl裂解液RL-plus，涡旋震荡30sec；

4)将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3，吸附柱CB3放在2mlRNase-Free的离心管中，12000rpm离心60sec；

5)向DNA吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3再放回收集管中；

6)加入500μl漂洗液PW于吸附柱CB3中，室温下静置约2min，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3再放回收集管中；

7)重复步骤6)；

8)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3在室温下放置3-5min，使吸附材料中残余的漂洗液彻底晾干；

9)将吸附柱CB3放入一个新的1.5mlRNase-Free的离心管中，加入100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液；

(2)引物设计，设计EGFR突变位点特异性引物序列；

(3)PCR反应体系：

(4)PCR反应条件；

(5)基因测序；

步骤三：CCK-8法检测细胞增殖率(按照试剂盒protocol进行操作)

(1)CCK-8操作方法：

收集肿瘤细胞，加完全培养基悬浮，细胞计数板计数后按照5000cells/well接种于96孔板，边缘孔用无菌PBS填充以防止过度蒸发影响实验结果，每孔100μl，每组设置6个复孔；在5％CO₂、37℃培养箱中培养过夜；给予无血清培养基饥饿处理4小时后，加入各组处理药物，置于5％CO2、37℃分别培养24h、48h、72h；以不加药物组为对照组，以仅含完全培养基不含细胞组为本底；检测时各组按10μl/well加入CCK-8试剂，37℃孵育1h测定OD450；扣除本底后，加药组OD值除以对照组OD值的比值即为细胞生存率；

计算公式：生存率＝(加药组OD-本底OD)/(对照组OD-本底OD)×100％；

(2)CCK-8法测肺癌细胞对吉非替尼的IC50值

收集肺癌细胞，加完全培养基悬浮，细胞计数板计数后按照5000cells/well接种于96孔板，边缘孔用无菌PBS填充以防止过度蒸发影响实验结果，，每孔100μl，每组设置6个复孔；在5％CO2、37℃培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃培养基，加入不同浓度梯度的吉非替尼，处理48h后按10μl/well加入CCK-8试剂，37℃孵育1h测定OD450，按上述公式计算细胞生存率，抑制率＝1-生存率；用IC50计算软件进行肺癌细胞对吉非替尼的IC50值的计算；

步骤四Westernblot

(1)细胞总蛋白提取

收集细胞，倒掉培养瓶中旧的培养基，用预冷的PBS溶液冲洗2次，加入0.05％胰蛋白酶消化5min，加入完全培养基终止消化，巴氏吸管转移细胞悬液至15ml离心管中，800rpm离心5min，仔细吸净上清液，向细胞沉淀中加入细胞裂解液(RIPA)120μl+浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF1.2μl，其中RIPA液：PMSF＝100:1，涡旋震荡10s，转移至1.5ml的EP管中，冰上静置裂解30min；4度低温离心机12000rpm离心20min，用100μl移液枪小心将上清蛋白液转移至新的EP管中，-80度冰箱保存备用；

(2)BCA法测蛋白浓度

根据样品量配制适量A液：B液＝50:1的BCA工作液，涡旋震荡混匀；根据BCA试剂盒protocol上样，绘制标准曲线，酶联免疫检测仪测定A562吸光度，计算蛋白浓度；

(3)配制SDS-PAGE凝胶

因mPRα分子量为40kD，故我们配制8％的分离胶。将玻璃板用双蒸水冲洗干净晾干备用，安装并固定于制胶架上；按照protocol配制8％的分离胶，用1000μl移液枪吸取制胶溶液缓慢注入两块玻璃板之间，液面距离胶架上缘约2.0cm停止注入，加入适量双蒸水封闭液面；室温静置约30min，若可见分离胶与双蒸水间有明显分界线提示分离胶已凝固；将制胶夹子从胶架取下，倾斜倒掉上层的双蒸水，并用滤纸小心吸净残留的双蒸水；按照protocol配制上层5％的浓缩胶，用1000μl移液枪吸取上层胶溶液缓慢注入分离胶上方，小心插入梳子，室温静置约30min上层浓缩胶可凝固，SDS-PAGE凝胶制备完毕；

(4)蛋白上样和电泳

已测定浓度的蛋白样品加入5xLoadingBuffer，其中，蛋白液体积：LoadingBuffer体积＝4:1，混匀后置于100度的加热器上10min使蛋白充分变性；计算上样50μg蛋白样品所需上样体积；准备好电泳槽，将制备好的凝胶玻璃板固定于电泳槽内，小心拔出上层胶的梳子，加入配制好的电泳液冲洗梳孔，玻璃板内外均加入电泳液；依次加入蛋白样品，两端梳孔各加入蛋白Marker5-8μl，并做好标记；插入电源，设置80V电泳，待含溴酚蓝染料的蛋白条带电泳至下层分离胶时调节电压为120V，待含溴酚蓝染料的蛋白条带电泳至下层胶底部时可停止电泳；

(5)转膜与牛奶封闭

根据上样孔数及切胶大小裁剪PDVF膜，不同膜做好标记，甲醇中浸泡10min，双蒸水漂洗，转膜液中浸泡备用。电泳完毕后将玻璃板取下，去除玻璃板，根据蛋白Marker条带切下目的蛋白及内参蛋白所在区域的胶；制备转膜“三明治”，即海绵-滤纸-胶-PDVF膜-滤纸-海绵，将转膜夹子固定于转膜槽中，注意黑板对黑板，白板对红板；倒入配制好的转膜液，恒流300mA进行转膜，mPRα转膜时间为1h，转膜完毕后，浸泡入配制好的5％脱脂牛奶溶液内，室温下摇床轻摇封闭1-2h；

(6)一抗、二抗孵育

封闭完毕的PDVF膜，用1xTBST溶液室温下置于摇床快速摇动洗膜3次，每次5min；浸泡入配制好的一抗孵育液，兔抗人mPRα抗体1:500；鼠抗人β-tubulin抗体1:3000，4度轻摇过夜；一抗孵育完毕，用TBST溶液充分洗膜，每次10min，共洗3次。浸泡入配置好的二抗孵育液：辣根酶标记羊抗兔IgG1:5000；辣根酶标记羊抗鼠IgG1:5000，室温下摇床轻摇孵育2h，TBST溶液洗膜3次，每次10min；

(7)发光与定量分析

根据发光试剂盒protocol配制发光液，打开化学发光成像仪，按照程序说明进行显像；采用ImageLab4.1软件测量蛋白条带灰度值，设定内参蛋白条带灰度值为100％，样品蛋白的相对表达量为该蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值；

步骤五：荧光定量PCR

(1)按照超纯RNA提取试剂盒protocol提取细胞中的总RNA；测定RNA浓度，计算加1μg所需体积；

(2)通过PrimerPremier5.0、Oligo6及BLAST设计验证，引物均跨内含子设计；

(3)参照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录反应，采用两步法完成；

1)冰上配制RNA-PrimerMix

逆转录第一步加样

2)RNA变性：65度10min，冰上冷却；

3)冰上配制反应体系

逆转录第二步加样

4)反应条件：37℃60min，85度5min；

5)-20度长期保存；

(4)PCR步骤：

1)反应体系配制10μl体系，注意所用耗材均应无核酶；

荧光定量PCR加样

2)反应条件：

荧光定量PCR上机参数

(5)结果分析：利用ABIViiATM7软件分析PCR结果；CT值表示检测样本扩增曲线与阈值的交点，即扩增由指数增长期到线性增长期的循环数；△CT＝样本的目的基因CT值均数-相对应的内参基因CT值均数；△△CT＝处理组△CT值-对照组△CT值；最后计算目的基因mRNA的相对表达量为2-△△CT；

步骤六：建立siRNAmPRα基因沉默细胞模型

(1)当细胞状态良好，处于对数增长期时可以考虑转染；细胞密度的控制很关键，在转染前24h，用胰蛋白酶消化细胞并用细胞计数板进行计数，使细胞密度在大约24h后转染时达到70-80％，将细胞铺板于无菌的6孔板中，每孔加入约2ml含10％血清，不含双抗的培基；

(2)对于每孔细胞，使用125μl无血清培养基：opti-MEM培养基，稀释siRNA终浓度为50nM，轻轻混匀；

(3)对于每孔细胞，使用125μlopti-MEM培养基稀释3.75μlLipofectamine3000试剂，轻轻混匀；

(4)将用opti-MEM培养基稀释过的siRNA和Lipofectamine3000试剂等体积混合，每孔总体积为250μl，混匀后于室温下静置5min使其反应；

(5)同时，6孔板中的细胞倒掉旧培养基，先用PBS轻轻洗一遍，再用opti-MEM培养基洗一遍，每孔加入2ml1640不含血清和双抗的基础培养基，；

(6)将步骤4中反应好的混合液加入到6孔板中，每孔250μl，在生物安全柜台面上水平摇动培养板，使转染混合液均匀覆盖细胞表面；置于37℃，5％CO2培养箱中培养6-8h；

(7)6-8h后，更换6孔板中1640基础培养基为含10％血清的培养基，培养箱中继续孵育24小时后，置于荧光显微镜下观察细胞发荧光情况，评估转染效率；

(8)利用Westernblot和荧光定量PCR技术检测mPRα基因沉默效率。基因沉默后mPRα表达水平下降70％即达到标准，选择沉默效果最佳的siRNA，用于后续细胞实验；

步骤七，结果统计：

实验至少重复3次，采用GraphPadPrism5软件进行数据录入和统计分析；所有计量资料的结果均对其进行正态性检验，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差的形式进行统计描述，不符合正态分布的计量资料采用中位数或四分位数进行统计描述；对于符合正态分布的计量资料组间的比较采用独立样本t检验或单因素ANOVA进行，而对于不符合正态分布的计量资料组间的比较则采用非参数检验；本研究检验水准选取双侧P<0.05表示差异有统计学意义。

进一步的，所述步骤二的(2)中，设计的EGFR突变位点特异性引物序列为：

进一步的，所述步骤三(2)中，不同浓度梯度的吉非替尼为：本底组、对照组、0.001uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM、100uM。

进一步的，所述步骤五(2)中，具体的引物序列为：

进一步的，所述mPRα介导孕酮抑制肺腺癌细胞A549的增殖，且该作用为快速非基因组作用。

进一步的，在EGFR野生型、突变型及耐药型三种肺腺癌细胞中，mPRα均能介导孕酮改善对EGFR-TKIs的敏感性。

进一步的，mPRα的表达水平与肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的耐药性呈正相关；在肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的耐药过程中，孕酮及其衍生物具有改善肺腺癌细胞的敏感性，延缓其耐药性的作用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，从女性激素的角度探讨孕酮经膜受体介导是否可以改善不同EGFR突变表型的肺腺癌细胞(EGFR野生型A549细胞、EGFR突变型PC-9细胞、EGFR耐药突变型PC-9GR细胞)对EGFR-TKIs的敏感性，拟为未来研究肺腺癌靶向药物增敏剂提供理论基础。

附图说明

图1：Westernblot技术检测mPRα蛋白在3株肺腺癌细胞中的表达差异。其中，以MCF-7为阳性对照，*P<0.0。

图2a：肺癌细胞EGFR19外显子基因测序报告；

图2b：三种肺癌细胞EGFR18外显子基因测序图谱；

图2c：三种肺癌细胞EGFR20外显子基因测序图谱；

图2d：三种肺癌细胞EGFR21外显子基因测序图谱。

图3a：P4作用A549细胞不同时间的细胞活性变化。

图3b：OD02-0作用A549细胞不同时间的细胞活性变化

(以不加药物处理为对照组，*P<0.05)。

图4：P4和/或吉非替尼对三种肺癌细胞增殖的影响；其中：(*P<0.05，#P<0.05，△P<0.05)。

图5：mPRαsiRNA转染效率评估：其中，左侧为普通光镜下采集的三种细胞图片，右侧为对应的荧光显微镜下红色激光激发下采集的三种细胞图片。

图6：Westernblot和荧光定量PCR检测mPRαsiRNA基因沉默效率；(1：空白组；2：空载siRNA组；3：干扰靶点siRNA1；4：干扰靶点siRNA2；5：干扰靶点siRNA3。图A1：A549细胞mPRα蛋白表达；图A2：A549细胞mPRαmRNA表达；图B1：PC-9细胞mPRα蛋白表达；图B2：PC-9细胞mPRαmRNA表达；图C1：PC-9GR细胞mPRα蛋白表达；图C2：PC-9GR细胞mPRαmRNA表达；)；

图7：mPRα基因敲除后，P4和/或吉非替尼对三种肺腺癌细胞增殖的影响；其中，(*P>0.05，#P>0.05，△P>0.05)。

图8nPR和PGRMC1阻断后，P4和/或吉非替尼对三种肺癌细胞活性的影响。(*P>0.05)图a表示A549细胞增殖活性52.8±4.5％VS56.4±9.2％，*P>0.05；图b表示PC-9细胞增殖活性40.5±3.7％VS45.4±7.5％，*P>0.05；图c表示PC-9GR细胞增殖活性32.7±5.1％VS38.2±10％，*P>0.05。未加阻断剂组VSPGRMC1-Ab组，图a表示A549细胞增殖活性52.8±4.5％VS53.4±6.1％，*P>0.05；图b表示PC-9细胞增殖活性40.5±3.7％VS42.6±7.4％，*P>0.05；图c表示PC-9GR细胞增殖活性32.7±5.1％VS36.9±5.4％，*P>0.05)，差异无统计学意义。

图9不同吉非替尼诱导下mPRα蛋白表达变化趋势(*P<0.05)。

图10不同吉非替尼诱导下mPRαmRNA表达变化趋势(*P<0.05)。图a表示PCR的扩增曲线，图b表示PCR的溶解曲线。

图11诱导耐药过程中，OD-02-0对肺腺癌细胞吉非替尼IC50的影响，(P<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

实验例：

1.1材料

1.1.1细胞

肺腺癌细胞株A549购自于中南大学湘雅医学院细胞库；肺腺癌细胞株PC-9、PC-9GR购自广州呼吸病研究所；乳腺癌细胞株MCF-7购自美国Emory大学医学院游绍进教授处。

1.1.2主要试剂与配制

1.1.2.1主要实验试剂及来源

1.1.2.2主要试剂配制

(1)细胞完全培养基(无菌，4度冰箱内保存备用)

RPMI-1640培养基90％

胎牛血清10％

青霉素链霉素双抗1％

(2)细胞冻存液(无菌，现配现用)

胎牛血清9份

DMSO1份

(3)PBS溶液(高压蒸汽灭菌，4度冰箱内保存备用)

PBS粉1包

双蒸水2000ml

(4)1X电泳缓冲液(常温保存备用)

(5)1X转膜缓冲液(常温保存备用)

(6)1XTBST缓冲液(常温保存备用)

TBST粉1包

Tween2.0ml

双蒸水调至2000ml

(7)8％SDS-PAGE分离胶(7.5ml体系，现配现用)

(8)5％SDS-PAGE浓缩胶(3ml体系，现配现用)

1.1.3主要实验仪器

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

(1)冻存细胞复苏

从液氮罐取出冻存的细胞迅速放入提前调好温度的37℃恒温水浴箱，轻轻摇晃冻存管，使细胞尽快融化。待细胞悬液完全融化后，喷洒75％的酒精消毒，放入已用紫外灯照射消毒好的生物安全柜中，用巴氏吸管将冻存管内细胞混悬液转移至无菌的15ml离心管中。加入5ml提前配制好的完全培养基，混匀，常温离心机800rpm，离心5min。弃上清液，加入5ml完全培养基混匀，转入无菌培养瓶中，置于37℃，5％CO2的细胞恒温培养箱中进行培养。

(2)细胞换液

从细胞恒温培养箱中取出细胞培养瓶，荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态，喷洒酒精消毒后放入生物安全柜中。倒掉培养瓶中旧的培养基，无菌PBS溶液轻轻冲洗3次，加入5ml新鲜的完全培养基，置于37℃，5％CO2的细胞恒温培养箱中进行培养。

(3)细胞培养传代

从细胞恒温培养箱中取出细胞培养瓶，荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态，如果细胞生长密度达80-90％则可以传代。喷洒酒精消毒后放入生物安全柜中，倒掉培养瓶中旧的培养基，无菌PBS溶液轻轻冲洗3次，加入1ml0.05％的胰蛋白酶液，置于恒温培养箱中消化3-5min，若荧光倒置显微镜下观察细胞的形态已收缩变圆形，可加入约3ml的完全培养基终止细胞消化过程。巴氏吸管轻轻吹打使细胞分散成单个，将细胞悬液平均分配到2个新的培养瓶中，每个培养瓶加入完全培养基至5ml，标记好细胞种类、传代日期和细胞代数，置于37℃，5％CO2的细胞恒温培养箱中进行培养。

(4)细胞冻存

在细胞冻存前24h需换液一次，取生长状态良好，处于对数期分裂细胞进行冻存。将细胞从培养瓶底部消化下来(步骤同前)。配制细胞冻存液，胎牛血清：DMSO＝9:1。用冻存液重悬细胞，并用巴氏吸管轻轻吹打细胞使之混匀，转移至冻存管中，进行梯度降温(-4度冰箱放置20min，-20度冰箱放置20min，-80度冰箱暂时保存，1周内转移至液氮罐中可长期保存)，注意标记好细胞种类、冻存日期和细胞代数。

1.2.2基因测序法检测EGFR突变状态

A549、PC-9、PC-9GR细胞的EGFR突变状态基因测序工作由生工生物(上海)股份有限公司完成。

(6)DNA提取(按照DNA提取试剂盒protocol进行操作)

10)准备工作：①向裂解液RL-plus中加入一定量的β-巯基乙醇使其终浓度为1％；②按试剂瓶上标注向漂洗液PW、缓冲液GD加入适量无水乙醇；③用RNase-FreeddH2O配制70％的无水乙醇。

11)收集细胞(数量<1x107个)，PBS溶液洗涤细胞，吸出PBS溶液，向细胞中加入含有0.05％胰蛋白酶消化细胞，当细胞脱离瓶底时，加入完全培养基终止消化，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，800rpm离心10min，收集管中细胞沉淀，仔细吸弃所有上清液。

12)裂解处理：对于离心后得到的细胞沉淀，手指轻弹离心管底部，使细胞沉淀变松散，加入约600μl裂解液RL-plus，涡旋震荡30sec。

13)将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3(吸附柱CB3放在2mlRNase-Free的离心管中)，12000rpm离心60sec。

14)向DNA吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3再放回收集管中。

15)加入500μl漂洗液PW于吸附柱CB3中，室温下静置约2min，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3再放回收集管中。

16)重复步骤6。

17)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3在室温下放置3-5min，使吸附材料中残余的漂洗液彻底晾干。

18)将吸附柱CB3放入一个新的1.5mlRNase-Free的离心管中，加入100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液。

(7)引物设计

表1：EGFR突变位点特异性引物序列

(8)PCR反应体系：

表2：50μl体系的配制

(9)PCR反应条件：

表3：PCR反应条件

(10)基因测序：由美国ABI3730XL测序仪完成。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖率(按照试剂盒protocol进行操作)

(1)CCK-8操作方法

收集肿瘤细胞，加完全培养基悬浮，细胞计数板计数后按照5000cells/well接种于96孔板(边缘孔用无菌PBS填充以防止过度蒸发影响实验结果)，每孔100μl，每组设置6个复孔。在5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。给予无血清培养基饥饿处理4小时后，加入各组处理药物，置于5％CO2、37℃分别培养24h、48h、72h。以不加药物组为对照组，以仅含完全培养基不含细胞组为本底。检测时各组按10μl/well加入CCK-8试剂，37℃孵育1h测定OD450。扣除本底后，加药组OD值除以对照组OD值的比值即为细胞生存率。

计算公式：生存率＝(加药组OD-本底OD)/(对照组OD-本底OD)×100％。

(2)CCK-8法测肺癌细胞对吉非替尼的IC50值

收集肺癌细胞，加完全培养基悬浮，细胞计数板计数后按照5000cells/well接种于96孔板(边缘孔用无菌PBS填充以防止过度蒸发影响实验结果)，每孔100μl，每组设置6个复孔。在5％CO2、37℃培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃培养基，加入不同浓度梯度的吉非替尼(本底组、对照组、0.001uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM、100uM)，处理48h后按10μl/well加入CCK-8试剂，37℃孵育1h测定OD450，按上述公式计算细胞生存率，抑制率＝1-生存率。用IC50计算软件进行肺癌细胞对吉非替尼的IC50值的计算。

1.2.4Westernblot

(1)细胞总蛋白提取

收集细胞，倒掉培养瓶中旧的培养基，用预冷的PBS溶液冲洗2次，加入0.05％胰蛋白酶消化5min，加入完全培养基终止消化，巴氏吸管转移细胞悬液至15ml离心管中，800rpm离心5min，仔细吸净上清液，向细胞沉淀中加入细胞裂解液(RIPA)120μl+浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF1.2μl(注：RIPA液：PMSF＝100:1)，涡旋震荡10s，转移至1.5ml的EP管中，冰上静置裂解30min。4度低温离心机12000rpm离心20min，用100μl移液枪小心将上清蛋白液转移至新的EP管中，-80度冰箱保存备用。

(2)BCA法测蛋白浓度

根据样品量配制适量BCA工作液(A液：B液＝50:1)，涡旋震荡混匀。根据BCA试剂盒protocol上样，绘制标准曲线，酶联免疫检测仪测定A562吸光度，计算蛋白浓度。

表4：BCA法测蛋白浓度加样

(3)配制SDS-PAGE凝胶

因mPRα分子量为40kD，故我们配制8％的分离胶。将玻璃板用双蒸水冲洗干净晾干备用，安装并固定于制胶架上。按照protocol配制8％的分离胶，用1000μl移液枪吸取制胶溶液缓慢注入两块玻璃板之间(尽量不要有气泡)，液面距离胶架上缘约2.0cm停止注入(为浓缩胶预留空间)，加入适量双蒸水封闭液面。室温静置约30min，若可见分离胶与双蒸水间有明显分界线提示分离胶已凝固。将制胶夹子从胶架取下，倾斜倒掉上层的双蒸水，并用滤纸小心吸净残留的双蒸水。按照protocol配制上层5％的浓缩胶，用1000μl移液枪吸取上层胶溶液缓慢注入分离胶上方，小心插入梳子(尽量避免产生气泡)，室温静置约30min上层浓缩胶可凝固，SDS-PAGE凝胶制备完毕。

(4)蛋白上样和电泳

已测定浓度的蛋白样品加入5xLoadingBuffer(蛋白液体积：LoadingBuffer体积＝4:1)，混匀后置于100度的加热器上10min使蛋白充分变性。计算上样50μg蛋白样品所需上样体积。准备好电泳槽，将制备好的凝胶玻璃板固定于电泳槽内，小心拔出上层胶的梳子，加入配制好的电泳液冲洗梳孔，玻璃板内外均加入电泳液。依次加入蛋白样品，两端梳孔各加入蛋白Marker5-8μl，并做好标记。插入电源，设置80V电泳，待含溴酚蓝染料的蛋白条带电泳至下层分离胶时调节电压为120V，待含溴酚蓝染料的蛋白条带电泳至下层胶底部时可停止电泳。

(5)转膜与牛奶封闭

裁剪PDVF膜(根据上样孔数及切胶大小)，不同膜做好标记，甲醇中浸泡10min，双蒸水漂洗，转膜液中浸泡备用。电泳完毕后将玻璃板取下，去除玻璃板，根据蛋白Marker条带切下目的蛋白及内参蛋白所在区域的胶。制备转膜“三明治”，即海绵-滤纸-胶-PDVF膜-滤纸-海绵(尽量避免气泡)。将转膜夹子固定于转膜槽中，注意黑板对黑板，白板对红板。倒入配制好的转膜液，恒流300mA进行转膜(mPRα转膜时间为1h)。转膜完毕后，浸泡入配制好的脱脂牛奶溶液(5％)内，室温下摇床轻摇封闭1-2h。

(6)一抗、二抗孵育

封闭完毕的PDVF膜，用1xTBST溶液室温下置于摇床快速摇动洗膜3次，每次5min。浸泡入配制好的一抗孵育液(兔抗人mPRα抗体1:500；鼠抗人β-tubulin抗体1:3000)，4度轻摇过夜。一抗孵育完毕，用TBST溶液充分洗膜，每次10min，共洗3次。浸泡入配置好的二抗孵育液(辣根酶标记羊抗兔IgG1:5000；辣根酶标记羊抗鼠IgG1:5000)，室温下摇床轻摇孵育2h，TBST溶液洗膜3次，每次10min。

(7)发光与定量分析

根据发光试剂盒protocol配制发光液，打开化学发光成像仪，按照程序说明进行显像。采用ImageLab4.1软件测量蛋白条带灰度值，设定内参蛋白条带灰度值为100％，样品蛋白的相对表达量为该蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值。

1.2.5荧光定量PCR

(1)按照超纯RNA提取试剂盒protocol提取细胞中的总RNA。测定RNA浓度，计算加1μg所需体积。

(2)通过PrimerPremier5.0、Oligo6及BLAST设计验证，引物均跨内含子设计。本研究中所有引物设计和合成工作均由生工生物(上海)股份有限公司完成。具体序列如下表：

表5：mPRα和GAPDH特异性引物序列

(3)参照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录反应，采用两步法完成。

4)RNA-PrimerMix(冰上配制)

表6：逆转录第一步加样

5)RNA变性：65度10min，冰上冷却。

6)反应体系(冰上配制)

表7：逆转录第二步加样

4)反应条件：37℃60min，85度5min。

5)-20度长期保存。

(4)PCR步骤：

3)反应体系配制(10μl体系)，注意所用耗材均应无核酶。

表8：荧光定量PCR加样

4)反应条件：

表9：荧光定量PCR上机参数

(5)结果分析：利用ABIViiATM7软件分析PCR结果。CT值表示检测样本扩增曲线与阈值的交点，即扩增由指数增长期到线性增长期的循环数；△CT＝样本的目的基因CT值均数-相对应的内参基因CT值均数；△△CT＝处理组△CT值-对照组△CT值；最后计算目的基因mRNA的相对表达量为2-△△CT。

1.2.6建立siRNAmPRα基因沉默细胞模型

(1)当细胞状态良好，处于对数增长期时可以考虑转染。细胞密度的控制很关键，在转染前24h，用胰蛋白酶消化细胞并用细胞计数板进行计数(使细胞密度在大约24h后转染时达到70-80％较适宜)，将细胞铺板于无菌的6孔板中，每孔加入约2ml含10％血清，不含双抗的培基。

(2)对于每孔细胞，使用125μl无血清培养基(opti-MEM培养基)稀释siRNA终浓度为50nM，轻轻混匀。

(3)对于每孔细胞，使用125μl无血清培养基(opti-MEM培养基)稀释3.75μlLipofectamine3000试剂，轻轻混匀。

(4)将用opti-MEM培养基稀释过的siRNA和Lipofectamine3000试剂等体积混合(每孔总体积为250μl)，混匀后于室温下静置5min使其反应。

(5)同时，6孔板中的细胞倒掉旧培养基，先用PBS轻轻洗一遍，再用不含血清培养基(opti-MEM培养基)洗一遍，每孔加入约2ml1640基础培养基(不含血清和双抗)。

(6)将步骤4中反应好的混合液加入到6孔板中，每孔250μl，在生物安全柜台面上水平摇动培养板，使转染混合液均匀覆盖细胞表面。置于37℃，5％CO2培养箱中培养6-8h。

(7)6-8h后，更换6孔板中1640基础培养基为含10％血清的培养基，培养箱中继续孵育24小时后，置于荧光显微镜下观察细胞发荧光情况，评估转染效率。

(8)利用Westernblot和荧光定量PCR技术检测mPRα基因沉默效率。基因沉默后mPRα表达水平下降约70％即达到标准，选择沉默效果最佳的siRNA，用于后续细胞实验。

1.3统计学方法

本课题所有实验至少重复3次，采用GraphPadPrism5软件进行数据录入和统计分析。所有计量资料的结果均对其进行正态性检验，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差的形式进行统计描述，不符合正态分布的计量资料采用中位数或四分位数进行统计描述。对于符合正态分布的计量资料组间的比较采用独立样本t检验或单因素ANOVA进行，而对于不符合正态分布的计量资料组间的比较则采用非参数检验。本研究检验水准选取双侧P<0.05表示差异有统计学意义。

2.实验结果

实施例1：

2.1不同肺腺癌细胞中mPRα蛋白的表达

本研究选取了三株mPRα表达阳性的肺腺癌细胞株A549、PC-9、PC-9GR。我们通过Westernblot技术检测了这三株细胞中mPRα蛋白的表达情况，结果如图1所示：以乳腺癌细胞株MCF-7作为阳性对照，β-tubulin作为内参，A549细胞中mPRα蛋白表达为阳性，PC-9细胞中mPRα蛋白表达为弱阳性，PC-9GR细胞中mPRα蛋白表达为强阳性。与MCF-7细胞相比，A549细胞、PC-9细胞、PC-9GR细胞mPRα蛋白的表达差异有统计学意义，*P<0.05，进一步验证了本实验选取的三种肺腺癌细胞株A549、PC-9、PC-9GR均为mPRα表达阳性细胞。2.2不同肺腺癌细胞中EGFR突变状态的检测

本实验选取了三种EGFR不同突变状态的肺腺癌细胞，即EGFR野生型A549细胞，EGFR突变型PC-9细胞，EGFR突变耐药型PC-9GR细胞。我们通过抽提细胞的总DNA，利用基因测序法检测了这三株细胞EGFR的突变状态，结果如图2a显示：A549细胞无EGFR19外显子缺失，PC-9细胞有EGFR19外显子缺失突变，缺失了CATCTCCGAAAG及后续的碱基序列，PC-9GR细胞有20外显子T790M突变，为获得性耐药突变，故PC-9GR细胞为EGFR突变耐药型。图2b显示了三株肺癌细胞EGFR18外显子基因序列。图2c显示了三株肺癌细胞EGFR20外显子基因序列。图2d显示了三株肺癌细胞EGFR21外显子基因序列。这部分实验结果验证了A549、PC-9、PC-9GR这三株细胞完全符合实验要求。

表10：EGFR测序报告

2.3孕酮作用A549细胞不同时间对其增殖状态的影响

为明确mPRα介导孕酮产生的效应是否为快速非基因组作用，我们用孕酮处理A549细胞10min、30min、60min、120min、180min，用CCK-8法检测细胞增殖活性。结果如图3a所示：当孕酮作用A549细胞10min时，A549细胞增殖受到明显抑制，细胞活性为72.02±6.7％，到30min时抑制作用较前减弱，细胞活性为81.41±4.2％，到60min时细胞活性为96.66±9.1％，表明此时孕酮对A549细胞已无明显抑制作用。120min时细胞活性为102.5±8.3％，180min时细胞活性为103.9±4.7％，60min-180min期间孕酮对A549细胞无明显抑制作用，换言之，mPRα介导孕酮产生的作用所需时间较短，小于60min。我们用mPRα特异性激动剂OD02-0(60ng/ml)处理A549细胞24h、48h、72h，用CCK-8法检测细胞增殖活性。结果如图3b示：24小时细胞活性为73.7±5.9％，48小时细胞活性为75.1±9.6％，72小时细胞活性为79.8±8.2％，均明显低于不加药物对照组，*P<0.05，差异具有统计学意义。

2.4不同药物组合处理对肺腺癌细胞增殖状态的影响

2.4.1孕酮和/或吉非替尼对肺腺癌细胞增殖活性的影响

如2.3中实验结果表明孕酮在短时间内(小于60min)抑制肺腺癌细胞的增殖，为充分发挥mPRα介导孕酮的快速非基因组作用，该部分实验我们设计孕酮对肺腺癌细胞的作用时间均为10min，然后用PBS洗脱。药物分组：对照组(不含药物组)、孕酮(P4)组、吉非替尼组(Gefitinib)、孕酮+吉非替尼组。孕酮在人体生理状态下浓度非常低(不同时期血清中孕酮浓度为0.2-200ng/ml)，且无明显的物种特异性，根据我们预实验基础选取孕酮最佳作用浓度为60ng/ml。查阅文献可知，A549细胞、PC-9细胞、PC-9GR细胞对吉非替尼的IC50值分别为：17.42uM、0.027uM、9.64uM，结合本实验的需要，选取吉非替尼作用于A549、PC-9、PC-9GR三株细胞浓度分别为：10uM、0.05uM、10uM。本实验利用CCK-8方法检测了不同药物组合处理三株mPRα表达阳性但EGFR突变表型不同的肺腺癌细胞(EGFR野生型A549细胞，EGFR突变型PC-9细胞，EGFR耐药突变型PC-9GR细胞)在24h、48h、72h三个时间点的细胞增殖活性差异。结果如图4所示：在A549细胞、PC-9细胞、PC-9GR细胞中，P4+Gefitinib组细胞增殖活性均低于单用Gefitinib组(图a表示A459细胞中：Gefitinib组VSP4+Gefitinib组24h时77.9±4.8％VS67.7±4.0％，48h时72.0±5.1％VS54.0±5.5％，72h时79.0±13.2％VS67.7±8.5％，*P<0.05；图b表示PC-9细胞中：Gefitinib组VSP4+Gefitinib组24h时70.7±2.7％VS57.3±8.1％，48h时67.2±2.7％VS39.8±2.8％，72h时78.9±9.9％VS70.5±5.4％，#P<0.05；图c表示PC-9GR细胞中：Gefitinib组VSP4+Gefitinib组24h时66.6±9.5％VS56.5±5.9％，48h时53.3±11.1％VS29.4±10.9％，72h时65.1±9.4％VS54.4±6.9％，△P<0.05)，差异有统计学意义，而且三种细胞均表现为48h时联合P4和Gefitinib处理细胞对其的增殖抑制作用最强，考虑可能与吉非替尼的最佳作用时间为48h有关。

2.4.2mPRα基因沉默后，孕酮和/或吉非替尼对肺腺癌细胞增殖活性的影响：为证明孕酮在前一部分实验中的这种作用是由mPRα介导的，我们用mPRαsiRNA对三株肺腺癌细胞进行基因沉默。我们用Cys-3标记的siRNA进行荧光标记评估三株细胞的转染效率，图5显示了三株肺腺癌细胞mPRαsiRNA的转染效率都可达到98％以上。然后，我们用Westernblot和荧光定量PCR验证了3个siRNA有效的基因沉默靶点，以GAPDH为内参，结果如图6所示：进行转染后，A459细胞、PC-9细胞、PC-9GR细胞的mPRα蛋白和mRNA表达均明显降低，其中A549细胞是siRNA1沉默效率最高，PC-9细胞是siRNA3沉默效率最高、PC-9GR细胞是siRNA1沉默效率最高，选用沉默效率最高基因靶点进行后续试验。mPRα基因沉默后，再进行3.4.1中分组实验，结果如图7所示：在A549细胞、PC-9细胞、PC-9GR细胞中，P4+Gefitinib组细胞增殖活性与Gefitinib组相比无明显差异(图a表示A459细胞中：Gefitinib组VSP4+Gefitinib组24h时74.8±7.0％VS74.6±2.9％，48h时67.6±4.4％VS68.0±8.9％，72h时82.6±6.7％VS80.1±12.2％，*P>0.05；图b表示PC-9细胞中：Gefitinib组VSP4+Gefitinib组24h时88.2±17.1％VS81.6±5.9％，48h时66.7±4.9％VS69.1±7.2％，72h时75.5±12.9％VS73.6±9.3％，#P>0.05；图c表示PC-9GR细胞中：Gefitinib组VSP4+Gefitinib组24h时53.4±10.5％VS46.7±7.9％，48h时44.7±11.9％VS42.1±7.4％，72h时63.7±12.7％VS69.8±6.2％，△P>0.05)，差异无统计学意义。

2.4.3nPR或PGRMC1对mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的影响：由于细胞膜表面可与孕酮结合的受体除了mPRα之外，还有nPR、PGRMC1等。为明确nPR和PGRMC1是否对该过程产生影响，我们分别用足量的nPR特异性阻断剂米非司酮(MIF)和PGRMC1抗体提前加入以阻断nPR和PGRMC1的作用。米非司酮为一种异常活跃的孕激素受体和糖皮质激素的阻滞剂，为保证米非司酮能完全阻断本研究中三种肺腺癌细胞中孕激素核受体(nPR)的作用，本实验用的米非司酮稍过量但又至于明显影响细胞的增殖活性，经预实验浓度摸索采用米非司酮浓度为1uM，米非司酮提前4h加入进行阻断。PGRMC1抗体可与PGRMC1受体特异性结合阻断其介导的细胞信号通路，根据PGRMC1抗体(H-46)说明书采用稀释浓度为1:100，本实验PGRMC1受体提前2h加入进行阻断。由于在3.4.1实验中，我们发现48h组联合P4和吉非替尼对肺腺癌细胞的抑制作用最强，因此，这部分实验我们选取吉非替尼作用时间仍为48h，结果如图8所示：与未加阻断剂比较，用米非司酮(MIF)，PGRMC1抗体提前加入阻断nPR和PGRMC1的作用后，三株肺腺癌细胞的P4+Gefitinib组细胞增殖活性未明显减弱或增强(未加阻断剂组VSMIF(+)组，图a表示A549细胞增殖活性52.8±4.5％VS56.4±9.2％，*P>0.05；图b表示PC-9细胞增殖活性40.5±3.7％VS45.4±7.5％，*P>0.05；图c表示PC-9GR细胞增殖活性32.7±5.1％VS38.2±10％，*P>0.05。未加阻断剂组VSPGRMC1-Ab组，图a表示A549细胞增殖活性52.8±4.5％VS53.4±6.1％，*P>0.05；图b表示PC-9细胞增殖活性40.5±3.7％VS42.6±7.4％，*P>0.05；图c表示PC-9GR细胞增殖活性32.7±5.1％VS36.9±5.4％，*P>0.05)，差异无统计学意义。

实施例2

2.5用吉非替尼诱导PC-9细胞成为耐药株PC-9GR细胞

为动态观察mPRα在肺腺癌细胞耐药过程中的作用，我们模拟机体内肿瘤的耐药环境，用梯度增加的吉非替尼体外人工诱导EGFR-TKIs敏感型肺腺癌细胞PC-9细胞成为耐药株PC-9GR细胞。诱导开始前我们测定PC-9细胞的吉非替尼IC50为0.034uM，故我们从低浓度(0.01uM)开始培养PC-9细胞，每天换新鲜含药培养基，若细胞死亡率较高则换不含药培养基进行培养，待细胞恢复生长再换用含药培养基。如果细胞增殖稳定则考虑进入下一浓度进行诱导，所用吉非替尼药物浓度依次为0.01uM-0.02uM-0.05uM-0.1uM-0.2uM-1.0uM-2.0uM-3.0uM。直至培养基中吉非替尼浓度为3.0uM时，PC-9细胞仍能稳定增殖，此时采用CCK-8法检测细胞的吉非替尼IC50值为9.12±0.424uM，与文献中PC-9GR的吉非替尼IC50值接近。根据下面公式计算耐药指数为268倍，高于文献报道的180倍[24]，证明耐药株PC-9GR细胞诱导建模成功。

2.5.1PC-9耐药过程中mPRα的表达变化

在诱导PC-9细胞耐药过程中，我们在每一个吉非替尼浓度点都提取细胞的总蛋白和RNA，通过Westernblot和荧光定量PCR技术检测mPRα蛋白和mRNA的表达变化。结果如图9所示：随着吉非替尼浓度的逐渐增加，mPRα蛋白的表达水平呈增加趋势(以吉非替尼0.01uM组为对照，β-tubulin为内参，吉非替尼浓度从0.01uM-0.02uM-0.05uM-0.1uM-0.2uM-1.0uM-2.0uM-3.0uM，mPRα蛋白的相对灰度值：0.25±0.08VS0.39±0.08VS0.55±0.02VS0.56±0.06VS0.79±0.03VS0.88±0.66VS0.91±0.04VS1.14±0.11，*P<0.05)。如图10所示：图a表示PCR的扩增曲线，图b表示PCR的溶解曲线，mPRα和GAPDH二者的溶解曲线均为尖锐平滑的单峰，提示引物特异性好。荧光定量PCR统计分析结果表明随着吉非替尼浓度的逐渐增大，mPRαmRNA的表达水平也呈增加趋势(以吉非替尼0.01uM组为对照，GAPDH为内参，吉非替尼浓度从0.01uM-0.02uM-0.05uM-0.1uM-0.2uM-1.0uM-2.0uM-3.0uM，mPRαmRNA的相对表达量：0.99±0.091VS2.098±0.43VS2.122±0.388VS3.438±1.183VS3.559±1.075VS4.043±0.956VS4.715±1.074VS6.40±1.235，*P<0.05)，与蛋白表达变化趋势一致。

2.5.2PC-9细胞耐药过程中不同药物处理对吉非替尼IC50的影响

在诱导PC-9细胞耐药过程中，我们另设一组同时加入mPRα的特异性激动剂(OrgOD02-0)，两组细胞同时进行吉非替尼耐药诱导，在同一浓度的吉非替尼诱导时用CCK-8法测两组的吉非替尼IC50值，两组比较结果如图11所示：加入OrgOD02-0后各浓度点测的吉非替尼IC50值均小于未加入组(G0.02uM时两组IC50比较：0.41±0.14uMVS0.065±0.011uM；G0.1uM时两组IC50比较：0.617±0.30uMVS0.17±0.011uM；G1.0uM时两组IC50比较：3.44±0.37uMVS2.16±0.57uM；G3.0uM时两组IC50比较：9.12±0.82uMVS5.27±0.93uM，其中G1.0uM和G3.0uM时，P<0.05，差异具有统计学意义)。近年来随着对女性激素和肿瘤关系的研究深入，各国研究者们逐渐认识到孕激素及其受体在肿瘤的发生、发展、预后等多方面起着至关重要的作用。越来越多的研究证明孕激素介导的信号通路参与细胞增殖、凋亡、分化等多种生理功能，并可对各种病理过程产生影响。在肿瘤细胞中，孕激素启动的细胞内激酶级联反应可调节基因的转录，进一步调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程。众所周知，孕激素既可以与mPRα等孕激素膜受体结合启动非基因组作用，又可以与细胞内的孕激素核受体(nPR)结合启动基因组作用，而不同类型的孕激素受体激活可能会产生截然相反的生物学效应。首先我们应该了解基因组作用与非基因组作用的区别。基因组作用是由核受体介导，它发挥作用依赖于基因的转录和蛋白质的合成，通过对靶基因的表达水平进行调控，来调节细胞的各种生理及病理过程。这种经典的基因组作用是一个相对缓慢的过程，启动的生物学反应通常需要几小时甚至几天时间完成。而非基因组作用是不依赖核受体的转录而产生的快速调节作用，该过程仅需数秒到数十分钟即可发生。

本研究为证明孕酮对肺腺癌细胞的抑制作用是由mPRα介导的快速非基因组作用，我们采用CCK-8法依次检测了P4作用于肺腺癌细胞株A549细胞在10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟多个时间点的细胞增殖活性，结果表明在10分钟时P4对A549细胞增殖起明显抑制作用，随时间延长抑制作用逐渐减弱，而60分钟之后抑制作用趋于消失。我们考虑在60分钟以内mPRα介导的快速非基因组作用起主导作用，而60分钟之后nPR介导的基因组作用增强而占据上风，所以此时孕激素对肺腺癌细胞的抑制作用逐渐消失甚至起促进增殖作用，说明选择性激活mPRα对肺腺癌增殖起抑制作用，且该作用为快速非基因组作用。与此结果一致的是，最近PeterThomas课题组利用内源性孕酮20β-S或OrgOD02-0证明了美国南方鲆精子膜上的mPRα(PAQR7)通过启动快速非基因组作用可上调精子活力，20β-S或OrgOD02-0仅作用1-5分钟即对精子活力表现出明显的促进作用。接着本研究用mPRα特异性激动剂OrgOD02-0(不激活nPR作用)处理A549细胞24小时、48小时、72小时发现其仍可抑制肺腺癌细胞A549的增殖活性，更进一步说明了选择性激活mPRα可抑制肺腺癌细胞的增殖活性，这也为后续在肺癌细胞耐药过程中动态观察mPRα的功能(3.5.2部分实验)提供了依据。

基于前面实验发现的mPRα可介导孕酮抑制肺腺癌细胞增殖的作用，我们进一步研究了mPRα在肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性方面的影响。如我们推测，研究结果表明在不同EGFR突变表型的肺腺癌细胞中(EGFR野生型A549细胞、EGFR敏感型PC-9细胞、EGFR耐药突变型PC-9GR细胞)均存在联合应用P4和吉非替尼比单独使用吉非替尼对肿瘤细胞增殖活性具有更强的抑制作用，而且这种优势在48小时组最为明显，考虑可能与吉非替尼的最佳作用时间为48小时有关。但是当三株肺腺癌细胞的mPRα基因被沉默后，对肺腺癌细胞的抑制作用反而消失了，从反面证明了该作用是由细胞膜表面的mPRα受体介导的。那么，我们思考这种作用到底是孕酮和吉非替尼对肺癌细胞的协同抑制作用？抑或是mPRα介导孕酮启动下游的信号通路调控了EGFR信号通路，然后影响肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性？既往有研究表明，mPRα介导孕酮激活的信号通路与EGFR信号通路存在交联，本课题组前期实验也证明了mPRα与EGFR和小窝蛋白-1(Cav-1)共同定位于细胞膜表面的小窝囊泡结构中，mPRα的过表达与EGFR表达阳性相关，而且本研究中P4对肺腺癌细胞株的处理时间仅为10分钟，但是将P4用PBS洗脱后再加入吉非替尼处理72小时之后这种作用仍然存在，故推测mPRα很可能通过介导P4改变了EGFR信号通路上关键分子的作用，从而改善了肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。此外，关于这种作用对于不同EGFR表型的肺腺癌细胞均适用这一现象，我们推测mPRα可能通过影响三株细胞共同的分子信号通路来调控肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性，具体机制需进一步研究。

研究发现，除mPRα之外，nPR和PGRMC1(ProgesteroneReceptorMembraneComponent1)在某些情况下亦可介导孕激素启动肿瘤细胞的生物学效应。为探讨nPR、PGRMC1是否参与这一过程，本研究分别采用nPR抑制剂米非司酮、PGRMC1抗体提前加入去阻断nPR和PGRMC1的作用。我们发现与未阻断组相比，阻断组对肺腺癌细胞的抑制作用并无明显减弱或增强，表明孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性是由mPRα介导的，而不是nPR或PGRMC1。与本实验结果不同的是，有研究表明，PGRMC1可与EGFR共沉淀，增加了肿瘤细胞对厄洛替尼(EGFR-TKIs)的敏感性，这一过程是通过增加质膜上EGFR的表达水平、稳定质膜上EGFR的功能和通过EGFR促进自分泌信号通路三方面实现的。由于PGRMC1与细胞膜表面的mPRα密切相关，它属于孕激素膜受体组分之一，参与孕酮结合位点的形成，因此我们推断PGRMC1发挥增加厄洛替尼敏感性的作用可能最终是通过mPRα实现的，但仍需进一步研究证明。在临床上，EGFR突变型的肺腺癌患者早期用EGFR-TKIs治疗时会出现肿瘤体积明显缩小，但是平均8-16个月后会出现肿瘤的进展，即出现获得性耐药。考虑到EGFR-TKIs耐药是个动态缓慢的过程，为研究mPRα在耐药过程中是否影响肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性，本实验将EGFR-TKIs敏感株PC-9细胞人工体外诱导为耐药株PC-9GR细胞。在诱导耐药过程中，检测了不同浓度梯度吉非替尼诱导下mPRα蛋白和mRNA的表达变化趋势，结果表明随着耐药程度的增加，mPRα在蛋白水平和mRNA水平均呈上升趋势，初步证明了mPRα与肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的耐药性存在相关性。接着我们设想利用mPRα特异性激动剂OrgOD02-0选择性激活mPRα的非基因组作用可能会对EGFR-TKIs的耐药性产生影响。于是，本研究在常规诱导耐药株的同时设置了加入OrgOD02-0的另一组进行对比。结果表明同时加入OrgOD02-0后，在每个诱导浓度点，肺腺癌细胞对吉非替尼的IC50值均低于未加入组，也就是说选择性激活mPRα后改善了肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性，延缓了肺癌耐药的发生，这与我们前面的药物分组实验结果一致，共同证明了mPRα介导P4或其衍生物(OrgOD02-0)改善了肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。

本课题首次从女性激素的角度研究了mPRα在肺腺癌靶向治疗中的重要作用，并为对EGFR-TKIs治疗不敏感的和耐药的肺癌类型提出一个新的治疗方向。这不仅有助于临床上重新考虑孕酮在肺癌治疗中的应用理论及方式，还将为人们寻找EGFR-TKIs增敏剂提供新的思路。新的靶向治疗药物可以与EGFR-TKIs协同或交替使用，在此基础上可以发展新的、个体化治疗方案，提高肺腺癌的治疗效果，改善晚期非小细胞肺癌患者的生活质量，因此本研究具有光明的应用前景。迄今为止，本研究仅在体外水平从现象方面阐述了mPRα在肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的作用，在体内水平的研究及其具体分子机制尚不明确。后续我们课题组将从mPRα介导孕激素启动快速非基因组效应方面并结合动物模型的建立，继续探索mPRα与EGFR信号通路的关键作用蛋白和信号调控网络，确定通路中各元件的组成及上下游关系，以期阐明mPRα介导孕激素对肺腺癌细胞抑制作用的分子机制，以及mPRα调控EGFR-TKIs敏感性和耐药性的具体分子机制。

4.结论

(1)mPRα介导孕酮抑制肺腺癌细胞A549的增殖，且该作用为快速非基因组作用。

(2)在EGFR野生型、突变型及耐药型三种肺腺癌细胞中，mPRα均可介导孕酮改善对EGFR-TKIs的敏感性。

(3)mPRα的表达水平与肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的耐药性呈正相关。在肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的耐药过程中，孕酮及其衍生物(OrgOD02-0)可改善肺腺癌细胞的敏感性，延缓其耐药性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。