基因敲除HPV16E6对宫颈癌细胞p63蛋白的影响

摘要

目的:
　　 通过分析不同HPV感染状态的宫颈癌细胞株在siRNA沉默HPV16 E6后细胞内p63蛋白的异构体TAp63α和△Np63α在mRNA和蛋白水平上的表达变化，为宫颈癌的发生机制研究提供新的理论依据，为使用RNA干扰技术治疗宫颈癌的可行性提供实验基础。
　　 方法:
　　 Western blotting检测不同宫颈癌细胞内p63的表达水平;构建HPV16 E6的siRNA，转染HPV16，18阳性的CaSki细胞，HPV16阳性的SiHa细胞及HPV18阳性的HeLa宫颈癌细胞;real-time PCR检测沉默前后TAp63α和△Np63αmRNA的表达变化;Western blotting检测沉默前后TAp63α和△Np63α，p53和p21的蛋白表达变化;使用SPSS17.0进行统计分析。
　　 结果:
　　 1.p63在C33A，CaSki，SiHa和HeLa细胞内的表达水平:Westernblotting检测结果显示，△Np63α在C33A，CaSki，SiHa和HeLa细胞内的表达水平分别为1.5486±0.037，1.1523±0.048，0.4967±0.058，0.4367±0.072(P＜0.000)。
　　 2.转染后SiHa细胞内HPV16 E6 mRNA的表达水平:RT-PCR结果显示，空白对照组(blank control)、NC组(negative control)、SⅠ组(siRNA303)、SⅡ组（siRNA73）和SⅢ组（siRNA191)HPV16 E6mRNA表达水平分别为0.6633±0.021，0.6967±0.031，0.2867±0.025，0.2267±0.006和0.2533±0.012，各组间差异有统计学意义(F=270.810，P=0.000)。转染后24小时，SⅠ组、SⅡ组和SⅢ组细胞内HPV16 E6mRNA表达水平比阴性对照组(negative control)分别减少了58.8％，67.5％和63.6％，减少有统计学意义（分别P=0.000，P=0.000，P=0.000）。
　　 3.转染后TAp63α和△Np63αmRNA在CaSki，SiHa和HeLa细胞内的表达边变化:real-time RT-PCR结果显示:TAp63αmRNA在CaSki，SiHa negative control组的表达水平分别为5.17×10-4±6.15×10-5和1.48×10-4±5.59×10-5;在siRNA组的表达水平分别为1.05×10-3±2.24×10-4和4.88×10-4±2.38×10-5;△Np63αmRNA在 CaSki，SiHa negative control组的表达水平分别为7.64×10-4±2.22×10-5和3.44×10-3±6.08×10-5;在 siRNA组的表达水平分别为3.23×10-4±1.80×10-5和4.61×10-4±1.29×10-5。沉默前后表达差异有统计学意义(P＜0.05)。而TAp63α和△Np63αmRNA表达在HeLa细胞中negative contral组和siRNA组的差异则没有统计学意义。
　　 4.转染后TAp63α、△Np63α、p53和p21蛋白在CaSki，SiHa和HeLa细胞内的表达变化:Western blotting结果显示，TAp63α在CaSki，SiHa细胞的negative control组的蛋白表达水平分别为0.0733±0.031和0.0300±0.010;在siRNA组的蛋白表达水平分别为0.0767±0.006的0.0733±0.032。△Np63α蛋白在CaSki，SiHa negative control组的蛋白表达水平分别为0.3767±0.105和0.3267±0.155;在siRNA组的蛋白表达水平分别为为0.1900±0.050和0.1400±0.052。p21蛋白在CaSki，SiHa negative control组的蛋白表达水平分别为0.0767±0.012和0.1600±0.035;在siRNA组的蛋白表达水平分别为0.2367±0.029和0.1433±0.029。p53蛋白在CaSki，SiHa的negative control组的蛋白表达水平分别为0.2333±0.127和0.1433±0.029;在siRNA组的蛋白表达水平分别为0.6200±0.329和0.6300±0.416。沉默前后蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05)。而TAp63α、△Np63α、p53和p21在HeLa细胞中negative control组和siRNA组的表达差异则没有统计学意义。
　　 结论:
　　 1.siRNA介导的基因沉默能有效的抑制HPV16阳性宫颈癌细胞内E6癌基因的表达。
　　 2.p63在不同HPV感染状态的宫颈癌细胞株C33A、CaSik、SiHa和HeLa均有表达，且△Np63α的表达水平较高，显著高于TAp63α亚型的表达。
　　 3.HPV16阳性的宫颈癌细胞在E6基因沉默后，细胞内△Np63α的表达水平下降，TAp63α的表达水平随之升高，说明△Np63α在宫颈癌细胞内可能起着癌基因的作用，促进细胞增殖。TAp63α在宫颈癌细胞内可能起着类似于p53的作用，调控细胞周期，促使细胞凋亡。我们的实验结果进一步证实△Np63α和TAp63α在宫颈癌细胞内的功能是相互拮抗的，两者在细胞内的功能失衡可能是导致宫颈癌发生的重要机制。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学分析

第三章 实验结果

3．1 p63在不同宫颈癌细胞株中的表达

3．2 转染siRNA后各组细胞内HPV16 E6 mRNA的表达变化

3．3 转染后各组细胞内TAp63α和ΔNp63α在mRNA水平上的表达变化

3．4 转染后各组细胞内TAp63α和ΔNp63α及p53和p21的蛋白表达变化

第四章 讨论

4．1 HPV与宫颈癌的关系

4．2 p63与宫颈癌的关系

4．3 TAp63α和ΔNp63α与宫颈癌的关系

4．4 siRNA沉默E6后对宫颈癌细胞株的影响

4．5 siRNA的在宫颈癌治疗中的应用前景

第五章 结论

参考文献

综述

致谢