肝细胞癌分子标志物的筛选及其生物学功能研究

摘要

第一章用蛋白质组学方法筛选肝癌特异性分子标志物
　　 目的:采用二维凝胶电泳与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（2-DE/MALDI-TOF MS）方法筛选并鉴定肝细胞癌组织(HCC)和癌旁无瘤组织的差异表达蛋白质，并分析其与临床病理学特征的相关性。
　　 方法:收集27对肝细胞癌组织和癌旁无瘤新鲜组织，用2-DE技术分离各组蛋白质，考马斯亮蓝染色后用PDQuest图像分析软件识别各差异蛋白质点，应用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)鉴定各差异蛋白质。分别抽提各组织的mRNA和蛋白质，用RT-PCR和Western blot法，对差异表达蛋白质PRDX3进行转录水平和蛋白质水平的验证。收集119例肝细胞癌组织和36例癌旁无瘤组织病理标本，用免疫组织化学法检测差异蛋白质过氧化物酶3(PRDX3)在各肝癌组织中的表达情况，进一步探讨PRDX3的表达与临床病理学特征之间的相关性。
　　 结果:(1)采用2-DE方法筛选到43个差异表达蛋白质点，并用MALDI-TOF MS鉴定了其中22个差异蛋白质，其中15个在HCC中表达上调，它们分别是:亚胺甲基转移酶环脱胺酶，线粒体醛脱氢酶，视网膜脱氢酶1，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，谷胱甘肽-S-转移酶A1，钙调磷酸酶B1，氨基酰化酶-1，T复合体蛋白11样蛋白1，抑素，磺基转移酶1A2，3-巯基丙酮酸硫基转移酶，硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶，人腔钙蛋白，果糖激酶。7个在HCC中表达下调，它们分别是:CAP-Gly结构域连接蛋白4，载脂蛋白A-(Ⅰ)，大同源物3，脯氨酰肽基异构酶A，二磷酸核昔激酶A，半胱氨酸蛋白酶抑制因子B。根据其功能，将上述蛋白质进行分类，其中与物质代谢相关的有9个(9/22，40.9％)，与抗凋亡相关的有4个(4/22，18.2％)，与信号转导相关的有7个(7/22，31.8％)，与氧化还原调节相关的有5个(5/22，22.7％)，与细胞骨架相关的有3个(3/22，13.6％)，与解毒作用相关的有2个(2/22，9.1％)，分子伴侣有3个(3/22，13.6％)，与蛋白质水解相关的有1个(1/22，4.5％)，涉及DNA合成和细胞分化的有2个(2/22，9.1％)。其中PRDX3蛋白(m/z1462.9，Mascot得分57分，序列覆盖率21％，mass28.02 kDa，pI7.67)因在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁无瘤组织，并与肿瘤中氧化应激反应有密切关系，是我们比较感兴趣的一个差异表达蛋白。
　　 (2) RT-pCR分析结果显示，PRDX3 mRNA在肝癌组织中的表达水平（0.79±0.14）显著高于癌旁无瘤组织（0.15-0.05）; Westernblot分析显示，PRDX3蛋白在肝癌组织中的表达水平（0.82±0.13）显著高于癌旁无瘤组织（0.52±0.09），差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 (3)免疫组化结果显示，PRDX3蛋白在肝癌组织中的表达(94.9％)高于癌旁无瘤组织及正常组织，并且其表达水平与肝细胞癌的低分化分级有显著相关性(p＜0.05)。
　　 结论:成功的筛选出了22个差异表达蛋白质，其中PRDX3在肝癌组织中高表达，且PRDX3的表达与组织分化程度相关，推测其可能参与肝细胞癌的发生、发展过程。
　　 第二章PRDX3 siRNA对HepG2细胞生物学功能的影响
　　 目的:检测PRDX3蛋白在各肝癌细胞株中的表达情况，及其对HepG2细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学功能的影响。
　　 方法:用RT-PCR、Western blot法检测PRDX3 mRNA和蛋白质在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、QGY-7703、HuH7及正常肝细胞系QSG-7701中的表达。构建含PRDX3的小干扰RNA的质粒pRNAT-PRDX3 siRNA，将该质粒转染至肝癌细胞HepG2，另设立阴性对照组和空白对照组，通过MTT、流式细胞术、平板克隆形成实验、划痕实验等检测PRDX3表达下调后对HepG2细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学功能的影响。
　　 结果:(1) PRDX3蛋白在所检测的四种肝癌细胞系中均有不同程度的表达，相对表达强度分别为0.32±0.03、0.33±0.03、0.29±0.02、0.31±0.04;在正常肝细胞QSG-7701中表达较弱。
　　 (2)稳定转染PRDX3siRNA后，HepG2细胞中的PRDX3mRNA和蛋白表达受到较为明显的抑制。MTT实验检测发现，PRDX3基因沉默组(HepG2/siPRDX3)细胞生长速度比阴性对照组(HepG2/siNC)细胞的生长速度减慢，克隆形成实验表明PRDX3基因沉默组（HepG2/siPRDX3）细胞的集落形成率明显下降，流式细胞术检测结果显示沉默组的凋亡细胞比例显著高于阴性对照组，细胞迁移实验表明PRDX3表达减少后，HepG2细胞的迁移能力下降。这些表明PRDX3基因可能通过调节肿瘤相关基因的表达水平来促进细胞增殖、保护肿瘤细胞抵抗凋亡，从而引起肝细胞的恶性转化。
　　 结论:PRDX3的表达能够促进肝癌细胞的增殖，抑制肝癌细胞的凋亡。PRDX3作为肝癌的候选分子标志物，可能是临床治疗肝细胞癌的潜在靶点。

目录

声明

摘要

缩略词简表

前言

技术路线

第一章 用蛋白质组学方法筛选肝癌特异性分子标志物

第一节 材料和方法

第二节 结果

第三节 讨论

第二章 PRDX3 SiRNA对HepG2细胞生物学功能的影响

第一节 材料和方法

第二节 结果

第三节 讨论

结论

参考文献

综述

致谢

在读期间主要研究成果