甘草酸18H差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶的影响及其机制的研究

摘要

祖国医学很早就认识到甘草具有调和诸药和解毒的作用，认为甘草可以缓解其它药物的毒性和烈性。中药方剂中很多配伍甘草以缓其性。大量临床实践和实验研究均证明了甘草“解百药毒”这一传统认识的科学性。甘草酸(glycyrrhizicacid，GL)是甘草的主要活性成分，其钾、钙盐为甘草甜素(glycyrrhizin)，水解后产生二分子葡萄糖醛酸和一分子甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)。由于其母核18位手性碳原子C-H键(18H)的构型不同，因此甘草酸存在两种差向异构体，即18α-甘草酸（18α-GL）和18β-甘草酸(18β-GL)，两者水解之后可生成相应的18α-甘草次酸(18α-GA)和18β-甘草次酸(18β-GA)。由于在我国具有自主知识产权的异甘草酸镁“手性肝药”在2006年上市，甘草酸异构体的差异日渐受到国内外学者的关注。本课题组前期研究发现18β-GL能够诱导P-gp的表达，本文从Ⅱ相解毒酶的角度，研究了甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶的影响及其机制的研究。
　　 目的：
　　 通过体内外实验研究甘草提取物及甘草酸18位差向异构体及其水解产物对UGT1A、UGT2B及其同工酶UGT1A1和UGT1A6和GSTπ的蛋白表达和转录水平mRNA的影响，探讨其对Ⅱ相解毒酶的作用是否具有立体选择性;拟初步证实甘草提取物及甘草酸18位差向异构体及其水解产物对Ⅱ相解毒酶诱导作用及其机制的研究;通过研究甘草酸制剂对对乙酰氨基酚药动学的影响，初步探讨甘草酸制剂与Ⅱ相解毒酶UGT底物在临床上可能发生的相互作用。
　　 方法：
　　 1.甘草提取物和甘草酸18H差向异构体分别从不同浓度和不同时间对大鼠体内Ⅱ相解毒酶的影响
　　 通过从不同浓度甘草提取物(90、180、360 mg·kg-1)以及18α-GL和18β-GL（12.5、25、50 mg·kg-1）和不同时间（3、6、12天）对大鼠进行灌胃诱导实验，用芯片阵列免疫组化技术手段实验考察试验药物对Ⅱ相解毒酶UGT1A和UGT2B及GSTπ的影响。
　　 2.甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物在大鼠体内对Ⅱ相代谢解毒中、高三个浓度为（1、10、100μM）。用荧光素报告基因法检测甘草提取物及其主要成分18α、β-GL和18α、β-GA对报告基因转录活性的影响。
　　 6.甘草酸制剂对对乙酰氨基酚药动学的影响
　　 采用随机开放，三周期交叉自身对照的拉丁方设计，12名受试者随机等分为3组，分别为甘草酸二胺胶囊组，即试验组;葡醛内酯组，即对照组;以及安慰剂组。洗脱期为2周。受试者于服药前（空白）和服药后0.16、0.33、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12和24小时点前臂静脉血4mL。分离血浆，立即置-70℃冰箱中保存，并在规定的时间内及时进行测定。尿样收集于给药前及给药后0～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h各时段尿液收集于一容器中，记录总量并留取标本，于-70℃保存备用。采用HPLC-MS/MS法测定血浆中对乙酰氨基酚及其结合物的浓度。使用DAS2.1.1软件计算药动学参数，SPSS17.0软件进行统计分析。
　　 结果与结论：
　　 1.肝组织的芯片阵列免疫组化实验结果经统计学分析，发现甘草提取物及18α-GL和18β-GL对Ⅱ相解毒酶UGT1A和UGT2B诱导作用成剂量依赖性和时间依赖性，对谷胱甘肽转移酶GSTπ也有诱导作用，但时间依赖性和剂量依赖性不明显。
　　 2研究结果表明，大鼠经实验药物诱导七天后，甘草提取物对UGT1A、UGT1A1、UGT1A6、UGT2B有明显的诱导作用。对GSTπ有诱导作用，但作用不明显。发现甘草的主要成分18α-GL和18β-GL对UGT及其部分同工酶UGT1A1、UGT1A6有诱导作用，其中18β-GL对Ⅱ相酶的诱导作用表现更加明显。18α-GA对UGT2B有明显的诱导作用，与18α-GA相比，18β-GA对UGT1A及其部分同工酶UGT1A1和UGT1A6的诱导作用更加明显。甘草酸和甘草次酸以及其差向异构体的在很多相互比较的研究中都有一定的差异，两者在代谢方面的区别应受到重视。
　　 3.甘草提取物在HepG2细胞中对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表达和转录水平mRNA的表达有明显的增强作用，18α、β-GL对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表达和mRNA的表达有增强作用，其中18β-GL对UGT1A1和UGT1A6蛋白表达和转录水平有显著的增强作用，这点与大鼠肝组织中报道的18β-GL较18α-GL对Ⅱ相酶诱导作用更明显较为一致;18α-GA和18β-GA在细胞水平对UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表达和mRNA表达比在大鼠肝组织中更加明显，尤其18β-GA在转录水平对UGT1A、UGT1A1、UGT1A6、UGT2B和GSTπ的mRNA表达量都具有明显的增加作用，在蛋白表达水平对UGT1A、UGT1A1也有明显增强作用。18β-GL和18β-GA对Ⅱ相酶的诱导作用可能具有同向性。
　　 4.甘草提取物、18α、β-GL和18α、β-GA通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性产生影响，在高剂量时这种影响更加明显。另外18α、β-GL对这种转录活性的影响有一定的差异性，尤其是18α-GL除了高剂量有较强的作用外，低、中剂量通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性产生影响不是很明显，然而18β-GL低、中、高剂量通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性的影响均有显著的增强作用。这也从作用机制方面解释了本课题前面研究报道的18β-GL对Ⅱ相解毒酶UGT有显著诱导作用真正原因。18α、β甘草次酸也通过核受体CAR或PXR对UGT1A1和UGT1A6转录活性产生影响，但仅在高剂量时这种作用较为明显。总之，甘草提取物、18α、β-GL和18α、β-GA通过诱导核受体CAR或PXR，从而进一步诱导下游UGT1A1和UGT1A6等一系列解毒靶基因的表达，这可能是甘草解百毒的重要作用机制之一，下一步可以从PXR/CAR介导解毒酶与外排泵的联合作用机制（如P-gp-UGT或MRP-UGT共转运体系）进行研究，以探明甘草解百毒真正联合机理。
　　 5.对乙酰氨基酚药动学实验表明，对乙酰氨基酚的药动学参数(AUC0-24，AUC0-∞，Cmax)在试验组和安慰组之间有较大差异，且AUC0-∞有统计学意义(P＜0.05)，同时也观察到对乙酰氨基酚的总体消除半衰期有所加快。在我们也比较对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸结合物(PG)血药浓度在三个实验组中的变化，发现甘草酸二胺胶囊组中的PG主要药动学参数与安慰组相比有显著变化，尤其是AUC0-24，AUC0-∞都有统计学意义(P＜0.05)。与安慰组相比，葡醛内酯试验组在整个过程中对对乙酰氨基酚及其结合物的主要药动学参数有所影响，但变化不大。据此我们推测甘草酸二胺胶囊组可能诱导Ⅱ相酶UGT，从而加快底物对乙酰氨基酚的代谢，使结合物的生成增加，进而促进排泄。葡醛内酯组结果显示，增加葡萄糖醛酸能在一定程度加快UGT底物的代谢和排泄，但起主要作用的可能还是由于诱导了Ⅱ相结合酶UGT所致。本试验中也有些APAP和PG主要药动学参数变化不明显，可能是我们诱导时间太短，也有可能是受试者体内影响底物对乙酰氨基酚代谢UGT同工酶的UGT1A6、UGT1A1和UGT1A9的多态性从而对有些药动学参数产生了影响，因此下步实验可以从扩大样本量，基因分型等角度来进一步研究甘草酸制剂对Ⅱ相解毒酶的诱导作用。
　　 本研究对甘草提取物、甘草酸18位差向异构体及其水解产物对UGT和GST的影响进行了探讨，在体内外实验中发现实验药物不同程度地对UGT1A，UGT2B及部分同工酶UGT1A1、UGT1A6，GSTπ有诱导作用;其中甘草提取物和18β-GL对Ⅱ相解毒酶的有显著诱导作用，验证了实验药物通过上调上游因子PXR和CAR信号通路从而增加下游UGT1A1和UGT1A6等一系列解毒基因的表达，可能这个信号通路是甘草解毒的重要机理之一，在比较差向异构体对Ⅱ相结合酶UGT和GST的作用是否存在立体选择性发现由于它们之间存在一定的差异，但没有显著的影响。本实验为临床上甘草应用于解毒治疗提供新的理论支持，也为其它具有解毒作用的中药研究提供新的思路，同时为临床药物相互作用研究提供科学的理论依据.

目录

声明

摘要

英文缩写词表

前言

第一章 甘草提取物和甘草酸18H差向异构体分别从浓度和时间依赖性对大鼠体内Ⅱ相解毒酶的影响

1 仪器与试剂

2． 实验方法

3．讨论

第二章 甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物在大鼠体内对Ⅱ相代谢酶的影响

第一节 肝微粒体实验

1．1 仪器与试剂

1．2 实验方法

1．3 实验结果

第二节 Western blot实验

2．1 仪器和试剂

2．2 实验方法

2．3 实验结果

第三节 免疫组化实验

3．1 仪器与试剂

3．2 实验方法

3．3 结果判断

3．4 讨论

第三章 细胞培养及细胞毒性试验

1．实验仪器、试剂

2．实验方法

3．结果

4．讨论

第四章 甘草提取物和甘草酸18位差向异构体及水解产物对Ⅱ相酶表达和转录的影响

第一节 western blot实验

1．1 仪器和试剂

1．2 实验方法

1．3 结果

第二节 Q-PCR实验

2．1 仪器和试剂

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论和小结

第五章 甘草提取物、甘草酸18H差向异构体及其水解产物通过核受体PXR及CAR对UGT1A1和UGT1A6转录活性的影响

1．仪器和试剂

2．实验方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第六章 甘草酸制剂对对乙酰氨基酚药物代谢动力学的影响

第一节 人血浆和尿液中对乙酰氨基酚及其结合物浓度的测定

1．1 仪器与试药

1．2 实验方法

1．3 讨论

第二节 甘草酸二铵胶囊对对乙酰氨基酚药代动力学的影响

2．1 仪器与试剂

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

全文总结

参考文献

综述

致谢

攻读博士学位期间主要研究成果