十二种疾病特异的iPS系和血小板无力iPS疾病模型的建立以及hESCs胞质中重编程相关因子的检测

摘要

疾病材料的获得对人类疾病的研究是十分重要的。人类疾病的发生发展十分复杂，以人本身作为实验和研究对象来深入探讨疾病发生机制以及致病机理，对医药学发展的推动是十分缓慢的，而且许多涉及人体的实验在道义上和方法上也受到限制。而疾病的动物模型由于种属差异、解剖和生理的不同，很多先天或获得性疾病的转基因动物模型不能真实的反映人类疾病的病理生理学。
　　 诱导性多能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出现使获得病人特异性的多能性干细胞成为可能。由于iPSCs类似于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有多能性，而且可以避免限制胚胎干细胞临床治疗的组织相容性问题，对于多种疾病，病人特异的iPSCs作为无限的细胞来源不仅在建立疾病模型而且在药物筛选和细胞替代治疗上都具有巨大的潜力。
　　 本研究利用iPS技术建立了十二种遗传性疾病特异的诱导性多能性干细胞系，其中9种疾病的iPS系国际上尚无报道，并以血小板无力为例探讨了疾病的iPS模型建立的可行性，为进一步的疾病机制研究和疾病治疗奠定基础。同时为了避免慢病毒感染方法所带来的安全性问题以及外源DNA的参与，本研究探讨了利用人胚胎干细胞胞质重编程体细胞的可行性，对人胚胎干细胞胞质可以重编程体细胞给出了直接证据，1为获得无外源DNA参与的病人特异的多能性细胞奠定了基础。本研究分两个部分，主要研究方法及结果如下:
　　 第一章十二种疾病特异的iPS系和血小板无力iPS疾病模型的建立
　　 第一节十二种疾病特异的iPS系的建立
　　 目的:1、利用慢病毒感染方法建立人成纤维细胞来源的诱导性多能性干细胞，并与hESCs比较其分化能力;2、建立多种疾病的iPSCs细胞系;
　　 方法:1、采用慢病毒感染的方法将Oct4/Sox2/Nanog/Lin28四种因子导入成纤维细胞获得诱导性多能性细胞(iPSCs)，对建立的iPSCs进行全面细致的鉴定，并且与本实验室分离得到的hESCs对分化过程中三胚层分化基因以及全能性基因的表达进行比较;2、收集多种遗传病病人皮肤的成纤维细胞，利用慢病毒感染方法建立多种疾病的iPSCs细胞系，并进行初步鉴定;
　　 结果:1、利用慢病毒感染的方法有效建立了人流产胚胎皮肤成纤维细胞来源的iPSCs系，获得iPS细胞的效率为10-5～-4，在表面标记，EB分化等方面获得的iPS细胞与胚胎干细胞相似，并经STR分析证实iPS确实来源于人胚胎成纤维细胞而非胚胎干细胞的污染;2、利用iPS技术建立了12种遗传病病人特异的iPSCs系，这些细胞系均具有胚胎干细胞的典型特征，其中所检测的细胞系均含有与其来源病人相同的基因突变或染色体改变。
　　 结论:利用慢病毒感染的方法能有效的建立来自12种疾病病人的iPSCs系，其中9种疾病iPSCs国际上尚无相关报道，为进一步的疾病机制和疾病治疗的研究提供了材料。
　　 第二节血小板无力iPS疾病模型的建立及初步研究
　　 目的:建立血小板无力(Glanzmann thrombasthenia，GT)患者特异的诱导性多能干细胞系，并将其向血小板方向诱导分化，探讨血小板无力的iPSCs能否作为疾病模型有效的体外重现血小板无力的发生获得具有疾病表型的血小板。
　　 方法:利用慢病毒感染的方法将血小板无力患者皮肤活检得到的成纤维细胞诱导得到血小板无力iPSCs(GT-iPSCs)，并对其进行干细胞特性鉴定。同时利用基质细胞共培养的方法诱导GT-iPSCs和hESCs向血小板方向诱导分化，并对得到的血小板进行表型检测和聚集功能分析，并利用病毒感染的方法进行初步的基因纠正。
　　 结果:从血小板无力患者的皮肤成纤维细胞建立了血小板无力iPSCs系，获得的GT-iPSCs具有胚胎干细胞的典型特征。体外可以向三胚层分化，通过与基质细胞共培养的方法诱导可获得血小板，与hESCs相比，诱导效率较低，获得的血小板无CD41a与CD61的表达，ADP刺激不能发生活化和聚集。经过基因修正后由GT-iPS得到的血小板样的颗粒表达CD41a并且能够参与微聚体的形成。
　　 结论:首次利用慢病毒感染方法获得了血小板无力的iPSCs，并能有效的体外重现疾病的发生，可作为进一步研究疾病机制和治疗的疾病模型。将正常的CD41基因转入GT-iPS细胞可以恢复血小板正常的聚集功能，说明在细胞水平上基因治疗是有效的，为今后的基因治疗开拓了一条新路。
　　 第二章阻滞于有丝分裂中期（M期）的胚胎干细胞胞质中体细胞重编程相关因子的检测
　　 目的:检测从有丝分裂中期（M期）的人胚胎干细胞分离获得的胞质是否含有重编程体细胞必要的重编程因子如OCT4，NANOG等，从而为分裂中期的人胚胎干细胞胞质具备重编程体细胞为病人特异的全能性细胞的能力提供依据。
　　 方法:检测了人胚胎干细胞中多能性相关因子OCT4/SOX2/NANOG在分裂期以及分裂间期细胞内的定位，并将人胚胎干细胞进行同步化后使用密度梯度离心法分离处于M期的胚胎干细胞的细胞质，进行全能性相关因子的检测。
　　 结果:处于M期的人类胚胎干细胞胞质含有OCT4、 NANOG和SOX2等重编程相关因子;联合应用胸腺嘧啶和TN-16可使48.83％±7.99％的hESCs同步于M期;通过密度梯度离心可有效的去除hES的细胞核，获得大量含有重编程因子的hES胞质。
　　 结论:本研究首次直接证实了阻滞于有丝分裂中期（M期）的人胚胎干细胞的胞质包含有重编程相关的因子，并可通过密度梯度离心的方法获得。对人类胚胎干细胞胞质可以重编程体细胞给出了直接证据，为获得无外源DNA参与的病人特异的多能性细胞奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

第一章 十二种疾病特异的iPS系和血小板无力iPS疾病模型的建立

第一节 十二种疾病特异的多能性干细胞系的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

1．4 图表与说明

第二节 血小板无力iPS疾病模型的建立及初步研究

1．材料与方法

2 结果

3 讨论

4 图表与说明

第二章 阻滞于有丝分裂中期(M期)的人类胚胎干细胞胞质中体细胞重编程相关因子的检测

1．材料与方法

1．1 研究材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 chHES-EGFP荧光细胞系的建立

2．2 M期的人类胚胎干细胞胞质含有重编程因子

2．3 通过同步化处理能使hES有效的阻滞于M期

2．4 通过密度梯度离心可有效的去除hES的细胞核

3 讨论

4 图表与图示

结论

参考文献

综述

致谢

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