舌癌耐药的相关新基因(TCRP1)多克隆抗体的制备及其相互作用蛋白的筛选和鉴定

摘要

背景和目的:
　　 在前期的研究中，我们通过基因芯片技术从舌癌耐平阳霉素细胞株(Tca/PYM)中筛选到一个全新的耐药相关新基因TCRP1，初步的功能研究发现，转TCRP1基因的舌癌细胞对顺铂的耐受性显著提高，提示TCRP1可能与顺铂耐药有着密切的关系，但TCRP1在组织细胞中的表达及分布特性、介导顺铂耐药的作用机制等均不明晰。因此，本研究拟通过生物信息学分析对TCRP1蛋白的理化性质及其功能等进行预测，制备抗TCRP1多克隆抗体，寻找能与TCRP1相互作用的蛋白并检测其功能，最终达到从分子水平阐明该基因在舌癌耐药中的作用机制，为实现舌癌化疗敏感性预测及耐药逆转提供实验基础和理论依据。
　　 方法:
　　 1.通过生物信息学的方法对TCRP1全长序列进行预测分析，以获得蛋白质的理化性质、抗原表位、亚细胞定位特性;
　　 2.构建pGEX-6P/TCRP1原核表达载体，表达、纯化获得具有生物学活性的TCRP1蛋白;免疫Balb/c小鼠获得抗TCRP1多克隆抗体;用该抗体通过WB、IFA、IHC检测TCRP1在各种肿瘤细胞株和舌癌组织中的表达及其亚细胞定位情况;
　　 3.构建TCRP1稳定干扰细胞株，采用人毒理学和药物抗性基因芯片(OHS-401)获得耐药基因TCRP1相关差异表达基因谱;实时定量PCR与WB法对基因芯片结果进行验证;对差异基因进行GO聚类分析;
　　 4.免疫共沉淀法寻找能与TCRP1直接结合的靶蛋白，再通过设计合成相应siRNA干扰片段将其与TCRP1进行沉默，MTS法、软琼脂集落形成和平板集落形成实验检测沉默后顺铂对舌癌耐药细胞的影响，流式细胞术检测沉默对耐药细胞凋亡的影响，WB法检测凋亡相关信号通路。
　　 结果:
　　 1.生物信息学分析提示舌癌耐药相关基因(TCRP1)，为一略偏碱性蛋白质，定位于11号染色体q13.4，包含有8个外显子，其等电点PI为9.327，理论分子量约为25kDa，具有较强的抗原性，为胞内表达蛋白，不存在跨膜区域同时也不会被细胞分泌出细胞外。
　　 2.成功构建pGEX-6P/TCRP1原核表达载体，通过正交设计得到TCRP1表达的最佳诱导条件并获得有活性的重组TCRP1蛋白，该蛋白具有DNA保护作用，能拮抗由顺铂所导致的舌癌细胞DNA损伤，使其出现顺铂耐受现象;WB检测发现TCRP1的表达并非肿瘤细胞特异性，而是顺铂耐药特异性，即在耐顺铂的细胞中表达明显高于其他细胞;IFA和IHC均显示TCRP1主要表达于细胞胞浆。
　　 3.成功建立TCRP1稳定干扰细胞株，功能组基因芯片共发现了30个与耐药细胞表达具有显著差异的基因，其中上调基因9个，下调21个;采用GO功能分类分析发现，在上调的基因中最多的是伴侣/热休克蛋白类基因。而下调基因基因中，最多的为转录因子和调控分子类。
　　 4.免疫沉淀结果提示MT1X和Akt能与TCRP1相结合，MT1X与TCRP1的表达水平呈正相关，TCRP1能调控MT1X的表达。MTS、软琼脂集落形成实验和平板克隆实验发现沉默TCRP1和/或MT1X的表达能够逆转舌癌耐药细胞对顺铂的耐受，流式细胞术分析发现与对照组相比随着TCRP1和MT1X被抑制后肿瘤细胞凋亡率逐渐升高，由对照组的8.04％分别上升到20.20％和，15.47％，联合应用MT1X和TCRP1干扰片段同时沉默TCRP1和MT1X的表达时，Tca/PYM细胞的凋亡率增加至37.48％，具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.构建了TCRP1基因原核表达载体，得到了高纯度的TCRP1蛋白，并获得了高效价的TCRP1多克隆抗体;
　　 2.TCRP1蛋白主要定位于细胞胞浆，其在多种肿瘤细胞中均有表达，但在对顺铂耐药的细胞中的表达明显上调;
　　 3.TCRP1可通过影响凋亡相关基因的活性，促进顺铂的代谢，加速顺铂向膜外转运等方式介导舌癌细胞对顺铂的耐受;
　　 4.MT1X和Akt能够与TCRP1相结合，TCRP1通过上调MTX1表达，增加MTX1螯合顺铂以减少其对DNA的损伤作用可能是TCRP1介导顺铂特异性耐受的主要途径;
　　 5.采用RNA干扰片段同时沉默TCRP1和MT1X基因的表达，可通过促进细胞凋亡有效逆转舌癌细胞对顺铂耐药。

目录

声明

摘要

缩写词简表

前言

第一部分 舌癌耐药相关基因TCRP1的生物信息学分析

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 TCRP1多克隆抗体的制备及其在肿瘤细胞和组织中的表达分析

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 TCRP1介导舌癌耐药相关基因谱的建立

引言

材料与方法

结果

讨论

第四部分 TCRP1相互作用蛋白的筛选和鉴定

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

在读期间的研究成果