舌癌候选耐药新基因TCRP1介导顺铂耐药及机制研究

摘要

背景与目的：舌癌是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤，临床常规采用手术并辅以化疗或放疗的综合治疗方法。由于化疗存在耐药且其机制未予阐明，舌癌的治疗效果一直不太理想。本研究将围绕课题组前期从舌癌多药耐药细胞(Tca8113/pym)中克隆的舌癌耐药相关基因TCRP1的功能开展相关研究，为进一步阐述舌癌化疗耐受机制，逆转舌癌耐药，提高舌癌临床化疗效果提供新的证据。 方法：(1)构建TCRP1真核表达载体，转染舌癌耐药亲代细胞Tca8113，筛选并挑取单克隆，建立TCRP1稳定表达细胞系(Tca8113/TCRP1)；(2)MTT方法检测Tca8113/TCRP1细胞对平阳霉素(Pingyangmycin，PYM)、顺铂(Cisplatin、cDDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil、5-Fu)、阿霉素(Adriamycin、ADM)、吡喃阿霉素(THP)等6种舌癌常用药物的敏感性，计算各药物的IC50值，筛选TCRP1介导的耐受药物；(3)针对TCRP1mRNA序列设计干扰片段，构建干扰表达质粒(pAU6+27/TCRP1-i)，瞬时转染TCRP1内源性高表达细胞舌癌耐药株(Tca8113/PYM)，观察干扰前后细胞对上述药物敏感性的差异；同时通过G418选择建立TCRP1表达稳定沉默的细胞系(Tca8113/PYM-i)；(4)采用MTT、平板克隆、软琼脂克隆实验观察Tca8113、Tca8113/v、Tca8113/TCRP1、Tca8113/pym、Tca8113/pym-i、Tca8113/pym-v等6株细胞的生长速度及对TCRP1功能相关药物顺铂的敏感性；(5)Hochest 33258染色、流式细胞计数、DNA ladder、及Western Blot等方法检测上述各组细胞药物诱导后的凋亡状况。 结果：(1)TCRP1外源性高表达Tea8113/TCRP1细胞对cDDP和PYM的耐受性明显增高，耐药指数分别是对照细胞的2.2倍和1.7倍(P<0.05)；但对5-Fu、ADM、VP-16、THP、的耐药性无明显改变；(2)TCRP1表达沉默细胞(Tca8113/pym-i)对cDDP的敏感性较沉默前细胞Tca8113/pym增加1.5倍(P<0.05)，而对包括PYM在内的其他药物的敏感性均无变化；(3)上述六组细胞的生长增殖速度无明显差异；(4)经顺铂处理后，Tca8113/TCRP1、Tca8113/PYM平板克隆形成的集落数分别为对照组的2.2和2.9倍；软琼脂克隆形成的集落数分别为对照组细胞的2.9和3.1倍(P<0.05)；TCRP1稳定沉默的Tea8113/PYM-i细胞比载体对照组细胞(Tca8113/PYM-v)分别降低2.2和1.4倍；(5)顺铂诱导后，Tca8113/TCRP1、Tca8113/pym细胞凋亡数较各自对照细胞(Tca8113/v、Tca8113/pym-v)降低，DNALadder电泳带形成不明显，Caspase-3表达降低，而Tca8113/pym-i细胞的上述各项指标较对照组细胞Tca8113/pym-v均升高。 结论：(1)TCRP1能特异性介导舌癌细胞对顺铂的耐受，仅在表达水平较高同时介导对平阳霉素的耐受，而与5-Fu、ADM、VP-16、THP敏感性无明显差异；(2)TCRP1介导的对顺铂的药物耐受与其能增强舌癌细胞对cDDP诱导的凋亡抗性有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章前言

第二章材料与方法

1材料

2. 方法

第三章结果

3.1重组质粒及转化细胞鉴定

3.2转染细胞药物敏感性筛选

3.3 TCRP1对细胞生长的影响

3.4顺铂对各组细胞集落形成能力的影响

3.5 TCRP1介导顺铂诱导的凋亡抗性

第四章讨论

结论

参考文献

综述 RLIP76的结构功能及在肿瘤研究中的进展

致谢

附录