氟非尼酮治疗糖尿病肾病db/db小鼠肾纤维化及其作用机制的研究

摘要

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见严重并发症之一，常发展成为终末期肾病(ESRD)。目前，临床治疗手段主要是控制血糖和抗高血压，但疗效有限，只能减慢糖尿病肾病向肾功能衰竭的进程。因此，必须针对糖尿病肾病的主要病理机制研发新的治疗药物。糖尿病肾病组织学损伤的主要特征是胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质(ECM)成分在肾小球系膜和肾小管间质进行性沉积，最终导致不可逆的肾纤维化。近年来，不少研究着力于寻找能有效抑制ECM在组织中沉积而治疗糖尿病肾病的药物，取得了一些前景诱人的成果。AKF-PD是一种新合成的低分子量化合物。我们研究组最近报道，在体外培养的小鼠肾小球系膜细胞和大鼠肾小管上皮细胞中，AKF-PD能够抑制转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激后引起的ECM的产生。
　　 目的：
　　 以糖尿病肾病db/db小鼠和MES13肾小球系膜细胞为实验对象，观察AKF-PD对肾纤维化的治疗效果，并深入揭示其作用机制，为研发治疗糖尿病肾病的抗纤维化新药提供实验证据。
　　 方法：
　　 1.10周龄雄性db/db小鼠分为1个不给药模型组和3个AKF-PD给药组（剂量分别为每日125、500、1000mg/kg体重）;相同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组。称体重和测血糖后，AKF-PD溶于羧甲基纤维素钠溶液作灌胃给药，不给药db/db组和db/m组小鼠作等量羧甲基纤维素钠溶液灌胃，各组小鼠每天灌胃一次，持续12周。实验期间2周一次测血糖水平。实验12周后，小鼠分单只置于代谢笼，收集24h尿标本。用ELISA法测定尿白蛋白浓度。处死各组小鼠。称体重后，取双侧肾脏，称肾重和剪取肾皮质。制备肾皮质组织切片，作PAS染色。光镜下观察组织切片，按每只小鼠20个肾小球，分5级（0～4级）进行每个肾小球损伤程度的评分，并计算肾小球系膜基质扩展指数(GMI)。用ELISA法测定肾皮质组织匀浆TGF-β1蛋白水平。以β-actin为内参作标化，real-time PCR方法检测肾皮质组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA的相对丰度。用肾皮质组织裂解产物作SDS-PAGE，进行western blot检测。以α-tublin为内参标化，检测TIMP-1、α-SMA蛋白质的相对含量。
　　 2.细胞周期同步化处理的小鼠肾小球系膜细胞系（MES-13）细胞分为6个组:(1)NG组(正常浓度葡萄糖，～5.6 mmol/L);(2) HG组（高浓度葡萄糖，25 mmol/L）;(3) AKF-PD组(HG+400μg/mLAKF-PD);(4) PFD组（HG+400μg/mL吡非尼酮）;(5) Los组(HG+2μmol/L氯沙坦);(6) OC组（渗透压对照组，NG+19.4mmol/L甘露醇）。各组细胞培养72h后，收集细胞和上清。用ELISA法测定细胞培养上清液的TGF-β1蛋白水平。以β-actin为内参，real-timePCR方法检测细胞Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TIMP-1、α-SMA mRNA的相对丰度。用细胞裂解产物作SDS-PAGE，进行western blot检测。以α-tublin为内参，检测TIMP-1、α-SMA蛋白质的相对含量。
　　 结果：
　　 db/db组小鼠的肾重明显大于db/m组小鼠(P＜0.05)。与不给药组相比，AKF-PD给药组db/db小鼠的肾重明显减轻(P＜0.05)，以500mg/kg剂量组效果最明显(P＜0.01)。
　　 db/db小鼠有严重的白蛋白尿，24h尿白蛋白排泄量达240.26±76.24μg，比db/m小鼠组升高8倍(P＜0.01)。AKF-PD给药显著减轻db/db小鼠的白蛋白尿(P＜0.01)，最大有效剂量为500mg/kg，可使24h尿白蛋白排泄量下降58.5％。
　　 从实验开始至实验结束，db/db小鼠始终有严重的高血糖，血糖一般维持于30mmol/L以上。AKF-PD给药组与不给药组db/db小鼠的血糖水平差异无显著性意义。
　　 与db/m小鼠相比，db/db小鼠的肾小球系膜基质PAS阳性染色区明显扩大，肾小球系膜基质扩展指数(GMI)显著增加(P＜0.01)。与不给药组db/db小鼠比，AKF-PD给药组db/db小鼠的肾小球系膜基质PAS阳性染色区明显缩小，GMI显著减低(P＜0.05)，其中，500mg/kg体重剂量组的GMI值减低约55.8％(P＜0.01)。
　　 db/db小鼠肾皮质的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA表达水平比db/m小鼠显著升高(P＜0.01)。AKF-PD显著抑制三种细胞外基质成分mRNA的表达(P＜0.05)。
　　 db/db小鼠肾皮质的TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平比db/m小鼠显著升高(P＜0.01)。AKF-PD显著抑制db/db小鼠肾皮质TGF-β1的表达(P＜0.05)。
　　 db/db小鼠肾皮质TIMP-1 mRNA和蛋白表达水平显著高于db/m小鼠(P＜0.01)。AKF-PD给药对db/db小鼠肾皮质TIMP-1的高表达具有显著下调作用(P＜0.01)。
　　 db/db小鼠肾皮质α-SMA mRNA和蛋白的表达水平显著高于db/m小鼠(P＜0.01)。AKF-PD给药明显抑制db/db小鼠肾皮质α-SMA的表达(P＜0.05)，其最大有效剂量为500mg/kg。
　　 与NG组相比，HG组MES-13细胞的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原mRNA表达水平显著增高(P＜0.01)。与HG组相比，AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)。且三种药物的作用相似。
　　 与NG组相比，HG组MES-13细胞的TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P＜0.01);与HG组相比，AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。而AKF-PD与PFD能使TGF-β1蛋白表达下调到接近NG组的水平，氯沙坦的这种作用较弱。
　　 与NG组相比，HG组MES-13细胞的TIMP-1 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P＜0.01);与HG组相比，AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的TIMP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)。且三种药物的作用相似。
　　 与NG组相比，HG组MES-13细胞的α-SMA蛋白表达水平显著增高(P＜0.01);与HG组相比，AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的α-SMA蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。且三种药物的作用相似。
　　 结论：
　　 AKF-PD长期给药对db/db小鼠的糖尿病肾病有治疗作用，可显著减少糖尿病肾病db/db小鼠24小时尿白蛋白排泄量，减轻肾小球系膜基质扩展，抑制肾组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质成分及TGF-β1、α-SMA、TIMP-1的表达。AKF-PD对db/db小鼠的高血糖无明显影响。
　　 AKF-PD能明显抑制高糖刺激下小鼠肾小球系膜细胞(MES-13)的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TGF-β1、α-SMA、TIMP-1表达。
　　 AKF-PD治疗糖尿病肾病肾纤维化的作用机制与其抑制肾小球系膜细胞TGF-β1的产生，抑制肾小球系膜细胞向肌成纤维细胞表型的转分化，抑制细胞外基质降解调节分子TIMP-1表达，调节肾脏细胞外基质降解平衡有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一章 AKF-PD对糖尿病肾病db/db小鼠肾纤维化的治疗作用

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．1 实验材料

1．2．2 实验方法

1．2．3 统计学分析

1．3 结果

1．3．1 一般资料

1．3．2 24小时尿白蛋白

1．3．3 血糖水平

1．3．4 肾组织病理改变

1．3．5 肾皮质ECM成分表达

1．3．6 肾皮质TGF-β1表达

1．3．7 肾皮质TIMP-1表达

1．3．8 肾皮质α-SMA表达

1．3．9 各目的基因Real-time PCR的标准曲线、扩增曲线及融解曲线

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 AKF-PD对高糖刺激MES-13细胞ECM表达的抑制作用

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 统计学方法

2．3 结果

2．3．1 MES-13细胞ECM成分mRNA表达

2．3．2 MES-13细胞TGF-β1表达

2．3．3 MES-13细胞TIMP-1表达

2．3．4 MES-13细胞α-SMA蛋白表达

2．3．5 各目的基因Real-time PCR的标准曲线、扩增曲线及融解曲线

2．4 讨论

2．5 结论

全文总结

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要的研究成果