EB病毒感染对microRNA-203的表达影响及其相互作用是鼻咽癌发病学的重要机制

摘要

[背景]
　　EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是具有高度转化能力的病毒,并与多种恶性肿瘤如伯基特淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)密切相关。但是,EBV在NPC发展中的作用尚未阐明。MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的非编码小RNA,主要通过与靶基因3’末端非翻译区互补配对,从而抑制靶基因的表达而发挥生物学功能,miRNA可以控制多种生物进程:如细胞增殖,凋亡和分化。越来越多的证据表明miRNA表达异常参与肿瘤的发生。然而,在NPC中EBV能否并如何调控细胞miRNA的表达仍需要阐明。
　　本课题利用前期构建的.EBV稳定感染293-EBV细胞系和对照组293细胞系进行miRNA芯片分析。筛选受EBV调控的差异miRNAs,从miRNA的角度研究EBV促进NPC发生发展的机制。
　　[miR-203在EBV感染的上皮细胞、淋巴细胞和低分化鼻咽癌组织中表达下调]
　　对293及293-EBV细胞进行miRNA芯片检测和分析,筛选差异表达超过2.5倍的miRNAs,其中3个表达上调,15个表达下调。miR-203是上皮细胞中特异表达的一个miRNA,并在多种上皮肿瘤中表达下调,具有抑瘤基因的功能,因此,本课题选择miR-203作为下一步研究对象。芯片结果显示miR-203在293-EBV细胞中下调约3.7倍。qRT-PCR证实miR-203表达水平和芯片结果保持一致;在EBV感染的上皮细胞、淋巴细胞中miR-203明显下调;然而在EBV丢失上皮细胞中miR-203的表达水平恢复明显;证实miR-203在低分化NPC组织较正常鼻咽组织中的表达水平下调4.25倍。[miR-203调控新靶基因E2F3、CCNG1参与抑制上皮细胞的生长和恶性转化能力]
　　通过miRBase软件分析差异表达miRNA分子的基本信息,在线miRNA靶基因预测软件targetscan和miRanda对下游靶基因进行分析,并利用荧光素报告载体活性检测实验证实E2F3和CCNG1是miR-203的直接调控的新靶基因。RT-PCR和Westernblot结果显示miR-203可以在mRNA和蛋白质水平调控靶基因的表达。
　　MTT和流式细胞结果表明miR-203具有抑制上皮细胞生长能力,能抑制细胞从G0/G1期向S期转换的进程;miR-203明显抑制裸鼠移植瘤肿瘤细胞的生长。免疫组化和原为杂交结果显示miR-203过表达的裸鼠瘤组织中靶基因E2F3和CCNG1表达下调。在上皮细胞中过表达靶基因E2F3和CCNG1能够逆转miR-203对上皮细胞生物学功能的影响。
　　[LMP1是EBV下调miR-203的关键病毒蛋白,并且通过激活JNK和NF-κB信号通路调控miR-203的表达]
　　潜伏膜蛋白LMP1和LMP2是EBV编码的重要癌蛋白。qRT-PCR结果证实EBV通过LMP1参与调控Pri-miR-203和Mature-miR-203表达下调而LMP2却无此功能;在EBV和LMP1稳定转染的上皮细胞中沉默LMP1表达后,miR-203的表达量恢复明显。免疫组化和原位杂交结果显示miR-203在NPC旁较癌组织中表达高;LMP1表达阴性NPC组织较阳性癌组织的miR-203表达明显增高。LMP1发挥生物学功能的主要区域是C端的CTAR1、CTAR2和CTAR3结构域。Western-blot和qRT-PCR结果显示LMP1蛋白CTAR1和CTAR2结构域通过激活JNK和NF-κB信号通路调控miR-203的表达;而p38信号通路对miR-203的表达没有明显影响。同时,qRT-PCR结果证实LMP1蛋白CTAR3结构域不能下调miR-203的表达。
　　[miR-203与鼻咽癌的侵袭转移及患者血清中EBV抗体VCA-IgA的表达水平密切相关]
　　研究显示miR-203在EBV感染的NPC组织中低表达,miR-203可能是NPC潜在的抑瘤基因。本研究应用NPC组织芯片,原位杂交结果显示NPC组织中miR-203表达水平与NPC淋巴结转移和患者血清EBV抗体VCA-IgA表达量紧密相关。NPC组织中miR-203表达越低,淋巴结转移率越高,血清EBV抗体VCA-IgA表达水平越高。