EB病毒介导的肿瘤细胞代谢改变及其重编程的分子机制研究

摘要

肿瘤的发生与发展是一个长期的多因素参与（物理因素、化学因素和生物因素）的多步骤过程。在这一个长期的多阶段、多因素参与的过程中，癌变的细胞内存在一套有别于正常细胞的异常代谢模式，为其无限增殖、侵袭转移等恶性表型快速而有效的提供生物合成所需的能量及原料。上世纪初德国著名的生物化学家Otto Warburg从细胞代谢角度首次提出了关于肿瘤的Warburg effect，即在肿瘤细胞中当线粒体功能失调后，细胞主要通过增强有氧酵解获得能量，葡萄糖代谢至丙酮酸后不再进入三羧酸循环进行有氧氧化，而是通过乳酸脱氢酶，转变成乳酸。在随后的几十年中，随着肿瘤代谢研究的不断深入和代谢组学技术平台的发展，研究人员逐渐能够从更为宏观的角度系统性的研究癌变过程中的代谢改变，将肿瘤代谢的研究从糖代谢领域衍生到了其他的代谢领域。
　　越来越多的证据表明，细胞癌变过程的代谢模式发生了显著变化，其涉及到糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和核酸代谢等诸多方面，研究人员将这一现象定位为肿瘤细胞的代谢重编程(Metabolic reprogramming)。肿瘤细胞的代谢重编程既是细胞内调控网络失调的结果，同时也是维持肿瘤细胞恶性表型的重要生化基础。2011年美国Whitehead研究所的Robert A.Weinberg教授等在“Cell”发表题为《Hallmarks of Cancer: The Next Generation》的综述文章，指出肿瘤代谢重编程是继生长信号的自我激活、对生长抑制信号的不敏感、对凋亡的逃逸、无限的复制能力、持续的血管生成能力和组织侵袭和转移之后的肿瘤的第七大特征，深入研究肿瘤的代谢异常及其分子基础正在成为肿瘤研究的重要方向之一。
　　EB病毒是上世纪60年代被首个证实具有致瘤性的DNA致瘤病毒，其感染与多种上皮性肿瘤以及血液肿瘤的发生发展存在直接关联。在维持EB病毒潜伏感染以及促进宿主细胞发生恶性转化过程中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1，LMP1)发挥了关键性作用。LMP1是目前被证实的EB病毒编码的癌基因，其主要通过活化NF-kappaB、PI3-K/Akt、MAPK和Myc等多条癌变过程中异常活化的细胞内信号转导通路，调控肿瘤细胞增殖、分化、转化及凋亡。大量的研究已经证实PI3-K/Akt信号转导通路和Myc是肿瘤细胞能量代谢重编程过程中的核心分子，我们课题组前期利用血清代谢组学分析技术已发现鼻咽癌患者中乳酸的含量明显高于健康人。基于以上研究背景及工作基础，我们推测EB病毒可能通过其编码的致瘤蛋白LMP1介导的异常活化的信号转导网络，促进肿瘤细胞多个代谢通路的重编程。
　　为研究EB病毒及LMP1介导的肿瘤细胞代谢变化，通过运用高通量的代谢组学分析方法，我们获得了EB病毒及其编码的致瘤蛋白LMP1介导的细胞代谢变化谱，发现EB病毒和LMP1能显著影响肿瘤细胞糖代谢、三羧酸循环、脂肪代谢等多个代谢途径，其中因乳酸及山梨醇的含量发生显著改变，使得EB病毒及LMP1介导的糖代谢异常尤为明显。进一步，我们利用生物化学方法检测稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞及对照细胞的葡萄糖的摄取速率和乳酸的生成速率，明确了LMP1能显著促进鼻咽癌细胞糖酵解速率。
　　为阐明LMP1促进肿瘤细胞有氧糖酵解的分子机制，通过筛选受LMP1调控的糖酵解相关基因，我们发现GLUT1、HK2和LDHA是LMP1介导的糖酵解异常活化的重要分子。LMP1介导的HK2过表达，不仅能促进鼻咽癌细胞有氧糖酵解，同时能促进肿瘤细胞增殖及拮抗凋亡，用特异性靶向LMP1的shRNA和脱氧核酶干扰鼻咽癌细胞中LMP1的表达后，能显著抑制HK2的表达并诱导细胞凋亡。用小分子抑制剂阻断PI3K/Akt信号转导通路，能显著逆转LMP1介导的异常活化的糖酵解，并抑制HK2的表达，此外我们的工作还提示LMP1亦有可能通过c-Myc调控HK2的表达。
　　为明确LMP1上调HK2的临床意义，我们在鼻咽癌临床样本中检测了LMP1与HK2的表达，发现LMP1与HK2的表达存在相关性，且HK2高表达与鼻咽癌患者放疗预后不良密切相关，这提示HK2高表达可能是LMP1增加鼻咽癌细胞放疗抵抗性的重要分子基础。进一步实验证实，干扰稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞中HK2的表达后能有效增加稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞的放疗敏感性。
　　以上研究工作从细胞能量代谢改变角度探讨了致瘤EB病毒病毒及其编码产物在细胞癌变过程中的作用，丰富了我们对于EB病毒致瘤机理的认识，为从EB病毒介导的细胞代谢重编程角度发展新的靶向预防、治疗及诊断策略提供了新的实验依据。

目录

声明

本课题受如下基金资助

摘要

英文缩写注解

第一章 EB病毒介导的细胞代谢紊乱

1．1 前言

1．2 实验材料与方法

1．2．1 材料

1．2．2 主要方法

1．3 实验结果

1．3．1 EB病毒及LMP1介导的鼻咽癌细胞代谢变化谱

1．3．2 明确LMP1能促进鼻咽癌细胞摄取葡萄糖及生成乳酸

1．3．3 与鼻咽癌变相关的未知代谢产物的鉴定

1．4 分析与讨论

1．5 本章小结

第二章 EB病毒介导肿瘤细胞糖代谢异常的分子机制

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 筛选受LMP1调控的糖酵解相关基因

2．3．2 明确被LMP1上调的HK2的生物学功能

2．3．3 阐明LMP1上调HK2的分子机制

2．4 分析与讨论

2．5 本章小结

第三章 鼻咽癌中LMP1介导HK2过表达的临床意义

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 在鼻咽癌临床样本中建立LMP1与HK2表达之间的相关性

3．3．2 HK2与鼻咽癌患者预后的相关性

3．3．3 干扰HK2表达影响鼻咽癌细胞的放疗敏感性

3．4 分析与讨论

3．5 本章小结

总结论

参考文献

综述

攻读学位期间主要的研究成果

致谢