半月板碎块法移植修复半月板无血运区损伤的实验研究

摘要

目的:1.探讨皮下埋植不同大小半月板碎块组织的生物学活性及其差异;2.观察幼年及成年动物半月板碎块体外培养与体内移植修复半月板无血运区损伤的效果。
　　方法:1.取成年家兔双膝内侧半月板，去除周围1/3，将其中内2/3切成不同大小的碎块:0.5mm×0.5mm×0.5mm（A组）;1.0mm×1.0mm×1.0mm(B组);2.0mm×2.0mm×2.0mm(C组),筋膜包裹后埋植于自体大腿外侧皮下。分别于皮下埋植1、2、3周时取出标本，行活细胞/死细胞荧光染色激光共聚焦显微镜观察细胞迁移;制作石蜡切片，HE染色观察细胞迁移;皮下埋植3周时，切片行番红O/固绿染色，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及PCNA免疫组化。
　　2.获取成年猪内侧半月板，于其中内2/3用环锯切取直径8mm，厚3mm圆柱体标本，于每份标本中央用环锯切取直径4mm，厚3mm中央圆柱体，将取出的中央圆柱体水平等分为上、中、下三份，每份厚1mm。将其中份取出，分别用不同的半月板组织移植替代:幼年猪半月板碎块（约0.5mm×0.5mm×0.5mm， A组）;幼年猪半月板整块（B组）;成年猪半月板碎块（取出的中份切成约0.5mm×0.5mm×0.5mm大小后回植，C组）;成年猪半月板整块（取出的中央圆柱体中份整块回植，D组）。移植物与中央圆柱体上、下份组成“三明治”结构后回植。标本进行体外培养，分别于培养2、4、6周时取出标本，激光共聚焦显微镜观察界面细胞聚集;制作石蜡切片，HE染色，分别观察移植物周围界面、碎块间界面修复情况;培养6周时，切片行番红O/固绿染色，天狼星红染色偏光显微镜观察，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原免疫组化，分析周围界面修复组织成分。
　　3.造成年家兔右膝内侧半月板体部无血运区损伤模型，损伤处分别移植不同的半月板组织:新鲜幼年兔半月板碎块（约0.5mm×0.5mm×0.5mm，A组）;新鲜幼年兔半月板整块（B组）;新鲜成年兔半月板碎块（约0.5mm×0.5mm×0.5mm，C组）;新鲜成年兔半月板整块（D组）。分别于术后第4周、8周，取出右膝内侧半月板标本行大体观察及组织学观察。
　　结果:1.兔半月板碎块组织皮下埋植1、2、3周，活细胞/死细胞荧光染色激光共聚焦显微镜观察结果显示半月板纤维软骨细胞向碎块表面迁移，在任意时间点A组至C组均逐渐减弱(P＜0.05)，与碎块大小呈负相关性(P＜0.05);各组随皮下埋植时间增加细胞迁移均逐渐增强(P＜0.05)。HE染色观察证实细胞向碎块表面迁移。皮下埋植3周时，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原免疫组化A组至C组均逐渐减弱(P＜0.05)，与碎块大小呈负相关性(P＜0.05); PCNA免疫组化A组强于B组，B组强于C组，A组与C组比较有统计学差异(P＜0.05);番红O染色各组无显著性差异(P＞0.05)。
　　2.成年猪半月板标本体外培养2、4、6周，激光共聚焦显微镜观察结果显示移植物周围界面有细胞聚集，在任意时间点，A组至D组细胞聚集均逐渐减弱(P＜0.05);随培养时间增加，各组周围界面细胞聚集均逐渐增加(P＜0.05)。HE染色:移植物周围界面修复在任意时间点A组至D组均逐渐减弱(P＜0.05)，碎块间界面A组均强于C组(P＜0.05);随培养时间增加，各组移植物周围界面及A、C组碎块间界面修复均逐渐增强(P＜0.05)。体外培养6周时，A、B、C三组移植物周围界面均有修复组织，番红O/固绿染色、天狼星红染色/偏光显微镜观察、免疫组化均显示修复组织中Ⅰ型胶原、Ⅱ性胶原共存。
　　3.兔体内实验中标本大体观察半定量评分在各时间点A组至D组均逐渐减少(P＜0.05);各组4周至8周界面愈合有增加的趋势，但仅C组有统计学差异(P＜0.05)。界面修复组织学半定量评分各时间点A组至D组均逐渐减少(P＜0.05);各组4周至8周界面修复有增加的趋势，但均无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:1.半月板碎块组织短期皮下埋植具有生物学活性，且与碎块大小呈负相关性;
　　2.初步证实半月板碎块体外培养与体内移植均能促进半月板无血运区损伤的修复，且幼年动物半月板碎块移植修复能力强于成年动物半月板。