miR-34a通过抑制HMGB1调节视网膜母细胞瘤自噬及化疗效果的机制研究

摘要

目的:探讨miR-34a能否通过HMGB1调控视网膜母细胞瘤细胞的凋亡及自噬，并增加DNA的损伤以提高化疗药物对视网膜母细胞瘤的治疗效果。
　　方法:培养人视网膜母细胞瘤细胞Y79及Weri-RB1后分四部分完成本实验研究。
　　1.miR-34a调节RB细胞HMGB1的表达:Y79及Weri-RB-1细胞转染miR-34a mimic或antagomir-34a后， qRT-PCR及Western-blotting分别检测HMGB1 mRNA及蛋白表达水平改变，萤光素酶检测分析HMGB13'UTR报告基因活性改变。
　　2.miR-34a通过调节HMGB1诱导凋亡并抑制自噬:Y79细胞转染miR-34a mimic、HMGB1 shRNA或同时转染miR-34a和pUNO1-HMGB1 cDNA72小时后Caspase3试剂盒及Annexin V/FITC试剂盒检测细胞凋亡及Caspase3活性，Western-blotting分析cleaved-cap3及cleaved PARP蛋白水平改变。
　　Y79细胞转染miR-34a mimic或HMGB1 shRNA72小时后HBSS饥饿培养1小时，Western-blotting检测LC3、p62及HMGB1蛋白水平改变，免疫荧光观察并计数LC3点状聚集改变，透射电镜观察并计数自噬空泡数量改变。
　　3.miR-34a通过抑制自噬增强RB细胞对化疗的敏感性:Y79细胞经长春新碱、依托泊苷或卡铂处理48小时后Western-blotting检测LC3及p62的蛋白水平。Y79细胞分别转染miR-34a mimic、HMGB1 shRNA、Beclin shRNA及Atg5 shRNA72小时后长春新碱、依托泊苷或卡铂处理48小时，计数LC3点状聚集数并检测细胞生存能力。
　　4.miR-34a通过抑制自噬增加RB细胞化疗后DNA的损伤:Y79细胞分别转染miR-34a mimic、HMGB1 shRNA及Atg5 shRNA后依托泊苷或卡铂处理48小时，Western-blotting检测γ-H2AX蛋白水平，Annexin V/FITC凋亡试剂盒检测凋亡水平改变。在Atg5基因干扰的细胞加入NAC再经依托泊苷或卡铂处理48小时，Western-blotting观察γ-H2AX蛋白及凋亡水平改变。
　　结果:Y79细胞和Weri-RB1细胞在转染miR-34amimic后HMGB1的mRNA水平、蛋白表达及3'UTR报告基因活性均下降，相反抑制miR-34a后HMGB1的mRNA水平、蛋白表达及3'UTR报告基因活性提高。
　　转染mir-34a mimic或HMGB1 shRNA后，Y79细胞的凋亡水平及Caspase3活性均明显提高，反映蛋白裂解水平的cleaved Cap3及cleaved PARP表达也增加。而通过转染pUNO1-HMGB1促使HMGB1过表达可以抑制由miR-34a mimic诱导的凋亡、Caspase3活性及cleaved PARP表达。
　　HBSS饥饿培养Y79细胞后HMGB1的mRNA在1-2小时内增加，后逐渐下降至基线水平，而miR-34a一直处于增加状态。通过增加miR-34a或减少HMGB1能抑制由饥饿诱导的LC3(Ⅱ)表达及LC3点状聚集，而使用溶酶体蛋白酶抑制剂E/P后可以恢复miR-34a mimic转染细胞内的LC3(Ⅱ)的表达水平。超微结构检查发现miR-34a mimic可以减少由饥饿产生的自噬空泡。
　　Y79细胞在经过长春新碱、依托泊苷或卡铂治疗后，LC3(Ⅱ)表达水平增加而p62下降。通过观察LC3点状聚集可以发现miR-34amimic及HMGB1 shRNA抑制了由长春新碱、依托泊苷或卡铂诱导的自噬，但增加了化疗药物对RB的作用效果。通过抑制自噬重要的调节因子Beclin1和Atg5也可以达到增加化疗效果的作用。
　　Y79细胞经依托泊苷或卡铂治疗后可以反映DNA损伤的γ-H2AX蛋白表达升高。miR-34a mimic、HMGB1 shRNA及Atg5shRNA均可增加由化疗诱导的凋亡及γ-H2AX表达水平。而抗氧化剂NAC可以减少由依托泊苷或卡铂诱导的DNA损伤。
　　结论:HMGB1是miR-34a在RB细胞内的作用目标之一。miR-34a可以减少HMGB1的mRNA水平以促进RB细胞的凋亡并抑制自噬，通过增加细胞DNA的损伤来提高化疗药物对RB细胞的治疗效果，为临床治疗RB提供新的思路及方法。

目录

声明

摘要

英文缩写注释

前言

第一章 miR-34a调节RB细胞HMGB1的表达

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 qRT-PCR及Taqman qRT-PCR结果

2．2 荧光素酶检测结果

2．3 Western-blotting结果

3 讨论

4 结论

第二章 miR-34a通过调节HMGB1诱导凋亡并抑制自噬

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1．miR-34a通过调控HMGB1诱导RB细胞凋亡

2．2．miR-34a通过调控HMGB1抑制自噬

3 讨论

4 结论

第三章 miR-34a通过抑制自噬增强RB细胞对化疗的敏感性

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 Western-blotting结果

2．2 共聚焦显微镜显示免疫荧光结果

2．3 细胞生存能力分析

3 讨论

4 结论

第四章 miR-34a通过抑制自噬增加RB细胞化疗后DNA的损伤

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 Western-blotting结果

2．2 Annexin V凋亡检测

3 讨论

4 结论

全文结论

参考文献

综述 MicroRNA与肿瘤

攻读学位期间主要研究成果

致谢