大鼠肝纤维化组织差异MicroRNA的筛选及其与纤维化相关性分析

摘要

在肝组织存在纤维化甚至肝硬化的病理改变基础上，各种致病因子的打击更容易造成严重的肝功能衰竭。终末期肝功能衰竭，临床治疗效果差，给人民健康及医疗财政带来了严峻的考验。众多研究表明肝纤维化形成机制复杂，但具有可逆性。近年来研究发现MicroRNA在调控肝纤维化形成过程中发挥着重要的作用，有研究表明促肝纤维化发展的MicroRNA，其抑制剂能有效的逆转肝纤维化。因此有关肝纤维化的MicroRNA研究可能为临床治疗肝纤维化带来新的突破。
　　第一部分:构建大鼠免疫性肝纤维化模型
　　目的:明确是否成功构建大鼠免疫性肝纤维化模型。
　　方法:将26只雄性Wistar大鼠随机分为两组(A、B)，A组10只，B组16只。A组为正常对照组，生理盐水腹腔注射（0.5ml/只，2次/周）连续12周;B组为肝纤维化模型组，其中随机选取3只为B1组，腹腔注射猪血清0.5ml/只/次，2次/周，共4周;继续随机抽选3只为B2组，腹腔注射猪血清0.5ml/只/次，2次/周，共8周;余下10只为B3组，腹腔注射猪血清0.5ml/只/次，2次/周，共12周。B1、B2组实验动物分别在第4周末及第8周末处死，留取肝组织进行HE染色、Masson染色，余下全部实验动物在第12周末次给药次日处死，留取肝组织进行HE及Masson染色，依据肝纤维化病理分期方案对大鼠肝纤维化程度进行评分，对胶原纤维面积实行半定量分析。
　　结果:1.HE及Masson染色图示:肝纤维化模型B1组的肝组织形态学改变不明显;B2组肝细胞存在肿胀变性，肝索结构排列较紊乱，结缔组织有增生，纤细的纤维间隔形成，但是未见假小叶;B3组肝小叶结构紊乱，肝索排列不规则，肝窦扭曲，结缔组织明显增生，纤维间隔形成;2.肝纤维化模型B3组肝纤维化程度及胶原纤维面积较正常A组明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　结论:通过连续12周向Wistar大鼠腹腔注射猪血清可成功构建大鼠免疫性肝纤维化模型。
　　第二部分:分析大鼠肝纤维化组织与正常肝组织中MicroRNA的表达差异
　　目的:探索大鼠肝纤维化组织与正常肝组织中MicroRNA的表达差异。
　　方法:在A组与B3组中分别选取3份肝组织标本，用trizol保存送至深圳华大基因进行RNA提取及MicroRNA高通量测序技术检测，然后分析其表达谱差异，再运用qPCR技术进行结果验证。
　　结果:与大鼠正常肝组织相比，在猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化组织中总共有9种MicroRNA发生了变化，其中MicroRNA-1、MicroRNA-30b-5p、 MicroRNA-144 MicroRNA-451、MicroRNA-674-3p表达下调，而MicroRNA-27a、 MicroRNA-138、MicroRNA-146b、 MicroRNA-342-5p则表达上调。
　　结论:在猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化组织中MicroRNA的表达谱较正常大鼠肝组织发生了变化，这些具有显著差异的MicroRNA可能与肝纤维化的发生相关。
　　第三部分:研究MicroRNA-138与肝纤维化细胞因子表达的相关性
　　目的:验证MicroRNA-138与肝纤维化的发生存在相关。
　　方法:运用qPCR技术检测A组及B3组（各10只，共20只）全部大鼠肝组织中MicroRNA-138的水平，并同时检测TGF-β、COL-1、TIMP-1、CTGF的表达。最后运用spss软件统计分析MicroRNA-138水平与TGF-β、COL-1、TIMP-1、CTGF表达的相关性。
　　结果:1.qPCR技术检测显示MicroRNA-138、TGF-β、COL-1、TIMP-1、CTGF在大鼠肝纤维化组织中的表达水平明显高于正常肝组织，差异具有统计学意义(P＜0.05);2.统计学分析MicroRNA-138与TGF-β、COL-1、TIMP-1及CTGF的相关系数分别为0.818、0.913、0.87和0.82，显著性均为p=0.000＜0.01，均有统计学意义。
　　结论:MicroRNA-138与猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维化的发生可能相关。

目录

声明

摘要

中英文缩略语表

前言

第一部分 构建大鼠免疫性肝纤维化模型

1．1 引言

1．2 材料

1．2．1 研究对象

1．2．2 主要试剂

1．2．3 主要仪器设备

1．2．4 病理染色试剂的配制

1．3 方法

1．3．1 实验动物分组及处理

1．3．2 标本采取

1．3．3 病理学图片制作

1．3．4 染色结果分析方法

1．3．5 统计学方法

1．4 结果

1．4．1 大鼠—般情况

1．4．2 HE及MASSON染色结果分析

1．4．3 两组肝纤维化分级及胶原面积百分比的比较

1．5 讨论

1．6 结论

第二部分 分析大鼠肝纤维化组织与正常肝组织中MicroRNA的表达差异

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 研究对象

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．3 方法

2．3．1 RNA的提取

2．3．2 RNA的纯度分析

2．3．3 MicroRNA表达差异的检测

2．3．4 qPCR验证各差异MicroRNA在两样本间的表达

2．4 结果

2．4．1 两组样本中所获得的MicroRNA数目

2．4．2 两组样本中存在表达差异的MicroRNA

2．5 讨论

2．6 结论

第三部分 研究MicroRNA-138与肝纤维化细胞因子表达的相关性

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 研究对象

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器设备

3．3 方法

3．3．1 提取RNA

3．3．2 RNA的纯度分析

3．3．3 MicroRNA-138表达水平检测

3．3．4 各细胞因子mRNA检测

3．3．5 qPCR所得数据结果分析

3．3．6 统计学方法

3．4 结果

3．4．1 MicroRNA-138及各mRNA的qPCR结果

3．4．2 MicroRNA-138及各mRNA表达水平及其相关系数

3．5 讨论

3．6 结论

参考文献

综述 肝纤维化形成机制的探讨

致谢