Runx1在脑死亡供体肝脏中作用机制研究

摘要

第一章兔脑死亡肝脏差异蛋白表达趋势检测
　　目的：根据前期蛋白质组学技术筛选出的显著性差异蛋白Runx1，研究其在脑死亡肝脏中表达趋势变化。
　　方法：使用免疫组化、PCR、western blot在转录翻译水平验证Runx1蛋白在脑死亡肝脏中表达水平变化。
　　结果：免疫组化、RT-PCR、Western blot检测脑死亡后Runx1蛋白在肝脏中表达水平变化，发现随着脑死亡持续时间延长，Runx1蛋白呈下降趋势，在8小时时间点表达水平最低(P＜0.05)。
　　结论：缓慢间断颅内加压法脑死亡后肝脏采用双向凝胶电泳和质谱分析，鉴定出Runx1蛋白表达水平在脑死亡前后肝脏细胞中有显著变化，该蛋白定位于细胞核内，是细胞增殖与分化相关蛋白质，随着脑死亡时间的延长，在肝脏中的表达逐渐减少，可能参与致肝脏损伤过程。
　　第二章 Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞作用的体外实验研究
　　目的：体外细胞实验探索Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞的作用。
　　方法：使用质粒为载体的全长度Runx1 eDNA pEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝脏，使Runx1基因过表达;转染pEGFP-N1为阴性对照组，对质粒转染后的大鼠肝脏细胞进行缺血缺氧处理;实验分为四组:对照组（C组）、缺血缺氧组(IS)、转染阴性对照+缺血缺氧组(S+IS)、Runx1过表达+缺血缺氧组(OS+IS)。流式细胞仪检测各组大鼠肝脏的细胞凋亡率，检测TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平，研究Runx1蛋白对缺血缺氧细胞肝脏作用机制。
　　结果：pEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝脏细胞48小时后Rux1蛋白表达水平达到峰值。PCR和Western blot检测Runx1表达水平在IS组和S+IS组较对照组明显降低(P＜0.05)，在OS+IS组较对照组表达明显升高(P＜0.01)。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，IS组和S+IS组较对照组细胞凋亡明显升高(P＜0.01)，OS+IS组细胞凋亡率较IS组和S+IS组明显降低(P＜0.05)。PCR检测大鼠肝脏细胞各组TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平。在IS组、S+IS组、OS+IS组中，TGF-β mRNA表达水平全部升高(P＜0.05)，三组之间没有明显差异(P＞0.05)。在IS组和S+IS组中，Bcl-2 mRNA与C组相比表达水平显著降低(P＜0.05)，但两组间没有统计学差异(P＞0.05)，Bim、TNF-α表达水平显著升高(P＜0.05);在OS+IS组中Bcl-2 mRNA表达水平明显升高(P＜0.05)，Bim、TNF-α mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)。Runx1表达水平的改变引起了Bcl-2/Bim、TNF-α mRNA表达水平的显著改变，因此Bcl-2/Bim、TNF-α是受到Runx1蛋白调控的下游信号分子。
　　结论：体外细胞实验证实，肝脏细胞在缺血缺氧后，Runx1明显降低，TGF-β、Bim、TNF-α等细胞凋亡相关因子明显升高;采用pEGFP-N1-RUNX1真核载体转染方法可有效的使Runx1在转录和翻译水平表达增加。过表达Runx1后，TGF-β表达含量无明显变化，而Bcl-2、Bim、TNF-α等凋亡相关因子表达显著变化;过表达Runx1后细胞凋亡率显著降低，这与Runx1诱导凋亡抑制因子Bcl-2升高并使得促凋亡因子Bim、TNF-α表达降低有关。Runx1是通过调控Bcl-2/Bim家族表达，经线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡;同时，Runx1促进TNF-α表达，通过细胞外凋亡途径引起细胞凋亡;
　　第三章 Runx1蛋白对脑死亡大鼠肝脏细胞作用机制的在体实验研究
　　目的：通过脑死亡大鼠在体实验研究进一步证实TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信号通路对脑死亡肝脏细胞作用机制。
　　方法：高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1，并实行脑死亡手术。将实验分为假手术组（C组）、脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)。检测各组肝脏在2h、4h、6h、8h时间点ALT、AST水平和肝脏形态学变化，以观察各组肝脏功能损伤;PCR检测各组2h、4h、8h时间点Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平，验证Runx1对肝脏作用机制。
　　结果：高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1在48小时后Runx1表达达到峰值，后逐渐下降。检测各组ALT、AST水平，与对照组相比，BD组与S+BD组ALT、AST的水平明显升高(P＜0.05)，但两组间相差无统计学意义(P＞0.05);OS+BD组在各个时间点血清中ALT、AST水平较BD组与S+BD组降低，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。肝脏形态学检测显示，与BD组相比，OS+BD组各时间点肝脏细胞损伤程度均减轻。PCR检测大鼠肝脏细胞假手术组（C组）、脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)中2h、4h、8h时间点Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平，GAPDH为参照。在各个时间点，脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)TGF-βmRNA表达水平升高，三组处理方式间无统计学差异(P＜0.05)。在各个时间点与假手术组相比，脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD) Bcl-2 mRNA表达水平降低，Bim、TNF-α表达水平升高(P＜0.05);而Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)，Bcl-2 mRNA表达水平明显升高，而Bim、TNF-α表达水平降低(P＜0.05)，相对应肝脏形态学，肝脏细胞坏死凋亡面积减轻，炎症细胞浸润减少。
　　结论：Runx1在体大鼠脑死亡实验证实，Runx1在脑死亡肝脏中表达含量的降低，引起肝脏细胞凋亡增加;Runx1对肝脏细胞的作用是通过TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信号通路来发挥对缺血缺氧肝脏细胞作用的。Bcl-2/Bim、TNF-α受到Runx1的表达调控，是Runx1的下游靶基因。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 兔脑死亡肝脏差异蛋白表达趋势检测

1．1 实验材料

1．1．1 实验器材

1．1．2 实验主要试剂

1．2 方法

1．2．1 蛋白质样品的制备

1．2．2 免疫组织化学验证

1．2．3 RT-PCR检测RUNX1 mRNA表达

1．2．4 Western blot检测Runx1蛋白质含量变化

1．2．5 统计分析

1．3 结果

1．3．1 免疫组织化学法验证RUNX1表达情况

1．3．2 RT-PCR检测RUNX1蛋白在肝脏中各时间点的表达

1．3．3 Western blot检测RUNX1蛋白在肝脏中各时间点的表达

1．4 讨论

1．5 小结

2 Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞作用的体外实验研究

2．1 实验材料

2．1．1 实验主要试剂

2．1．2 实验设备

2．2 方法

2．2．1 实验分组

2．2．2 建立pEGFP-N1质粒转染的Runx1过表达

2．2．3 氧糖剥夺(OGD)模型大鼠肝细胞缺血缺氧模型建立

2．2．4 RT-PCR检测mRNA表达水平

2．2．5 Western blot检测蛋白表达水平

2．2．6 流式细胞仪检测对照组、缺血缺氧组、过表达组细胞凋亡

2．2．7 统计分析

2．3 结果

2．3．1 pEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝细胞结果

2．3．2 缺血缺氧处理大鼠肝脏细胞模型建立

2．3．3 RT-PCR检测各组Runx1 mRNA表达水平

2．3．4 Western blot检测各组Runx1蛋白表达水平

2．3．5 流式细胞仪检测缺血缺氧组、过表达组、阴性对照组和对照组细胞凋亡

2．3．6 PCR检测各组TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平变化

2．4 讨论

2．5 小结

3 Runx1蛋白对脑死亡大鼠肝脏细胞作用机制的在体实验研究

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 实验器材

3．1．3 实验主要试剂

3．1．4 实验一般用品

3．2 方法

3．2．1 实验分组

3．2．2 pEGFP-N1质粒转染大鼠

3．3 结果

3．3．1 高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1

3．3．2 大鼠脑死亡模型建立

3．3．3 脑死亡后肝脏功能检测

3．3．4 大鼠脑死亡肝脏形态学检测

3．3．5 PT-PCR(Real-time PCR)检测mRNA表达

3．4 讨论

3．5 小结

4 结论

参考文献

附录

综述一 RUNX转录因子家族

综述二 脑死亡后机体系统性炎症及病理生理改变

攻读学位期间的主要研究成果

致谢