转移远缘物种基因组DNA创新种质及分子机理研究

摘要

利用远缘物种创新种质是植物遗传育种的前沿方向。外源DNA直接导入受体植物技术是我国科学家发明、倡导的遗传操作方法。前人将远缘物种基因组DNA转移到各种受体植物中，创制出了丰富的变异材料，实现了对受体农艺性状的综合改良。但由于其中蕴藏的分子机制，特别是变异系表型和基因型变异的全貌、外源特异DNA片段的转移和整合，及性状变异的分子机理等迄今尚不清楚，行内对此途径创新种质存在居多困惑与质疑。
　　本文开展了“穗茎注射法”(Spike-stalk injection method，SIM)创新水稻(Oryza.sativa L.)种质，其遗传分离规律及相关分子机理的研究。尝试将不同远缘物种基因组DNA导入到不同受体水稻亲本材料中创造水稻变异新种质，并对低世代变异系的遗传分离规律及高世代变异系中外源DNA导入相关分子机理进行了研究，主要内容如下:
　　1.采用“穗茎注射法”，将高粱、玉米、稗草、拟南芥和不同野生稻等基因组DNA分别导入到受体水稻9311和RH78中，得到了一批株高、产量性状和叶片等性状得到显著改良的变异材料，变异率约为0.7‰-4.4‰; SSR(simple sequence repeat)和indel(insertion anddeletion)标记分析变异单株与供受体之间的遗传多样性发现:变异与受体之间的遗传多样性为0.88％-32.93％、且外源DNA导入过程中存在“突变热点”(mutation hotspot)现象;
　　2.通过对D1代变异单株ERV1及其受体水稻RH78的全基因组深度重测序，ERV1自交D2代群体216个株系的RAD(Restriction-siteassociated DNA tags)测序及产量相关性状的QTL(quantitative traitlocus)关联分析和比较基因组分析发现:(1)相对于受体RH78，ERV1千粒重，每穗粒数和结实率显著增加;(2)相对于受体基因组，在ERV1中共检测到5，518个纯合的SNPs和449，726个杂合SNPs，且这些SNPs位点在染色体上的分布是不均匀的;(3)在ERV17,325个基因的编码区(coding sequence region，CDS)共检测到14，955个非同义SNP(non-synonymous SNPs)突变;(4)共定位到13个与抽穗期，株高，主穗穗长，有效分蘖数，结实率，百粒重有显著关联性的基因或QTLs区间，这些区间的表型贡献率约4.8％-10.5％;(5)D2代群体中216个株系的平均基因组纯合度为88.2％，约50％的株系纯合度达到90％以上，平均基因组杂合度为1.57×10-4;
　　3.高世代稳定变异系YVB及其受体水稻V20B之间的性状调查及比较分析发现:V20B和YVB在形态和生理生化上存在极显著的差异，特别是YVB稻米品质性状得到明显改良;通过YVB，V20B和小粒野生稻的全基因组测序及比较基因组分析，在YVB和V20B之间检测到大量的遗传变异，包括310，500个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs，44，305个小片段插入缺失(small indels)和7，771个结构变异(structure variations，SVs)，同时，在YVB基因组上筛选并验证12个来源于供体小粒野生稻不同大小的特异片段或基因;通过对YVB×V20B BC1F5群体100个株系品质相关性状的QTLs关联分析，初步证明了Wx和DEP1基因序列的变异是YVB中胶稠度和粒长性状变异的关键基因，另外，在5号染色体4.3-5.1CM范围内定位到一个LOD值较高的QTL区间，该区间同时与千粒重、粒宽、整精重和平均垩白面积显著相关，存在明显的“一因多效”效应，该区间内已经克隆的GS5或GW5基因序列的变异可以解释YVB中米质性状的变异。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 绪论

1．1 利用远缘物种创新水稻种质的主要方法

1．1．1 远缘杂交

1．1．2 基因工程

1．1．3 外源DNA导入植物技术

1．2 外源DNA导入相关机理研究进展

1．3 基因组学研究进展

1．3．1 下一代测序技术及其应用

1．3．2 RAD(Restriction-site associated DNA tags)测序技术及其应用

1．3．3 水稻功能基因组组学研究进展

1．4 本课题研究内容和目的意义

2 穗茎注射法创新水稻新种质及其遗传多样性分析

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 用于穗茎注射法的水稻供体和受体

2．1．2 主要试剂与配方

2．2 实验方法

2．2．1 植物基因组DNA提取方法

2．2．2 穗茎注射法流程

2．2．3 PCR检测变异材料与亲本之间的遗传多样性

2．3 结果与分析

2．3．1 穗茎注射法历年所用供受体、变异单株数和变异率统计

2．3．2 变异株与供受体之间的遗传多样性分析

2．3．3 变异株和供受体之间的带型分布特点

2．3．4 外源基因组DNA导入过程中的“重组突变热点”现象

2．4 讨论

3 导入紧穗野生稻D1代变异株和D2代自交群体遗传、分离规律研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 表型鉴定

3．2．2 RH78和ERV1基因组深度重测序

3．2．3 群体RAD测序及比较基因组分析

3．3 结果与分析

3．3．1 重测序样本表型鉴定及比较分析

3．3．2 重测序基本数据统计

3．3．3 ERV1和RH78之间SNP的检测及分析

3．3．4 群体RAD测序

3．3．5 群体基因分型和遗传连锁图谱构建

3．3．6 表型鉴定

3．3．7 QTL定位

3．3．8 D2代株系基因组纯合度，杂合度及自发突变率分析

3．4 讨论

4 导入小粒野生稻高世代稳定变异系遗传、分离规律研究

4．1 实验材料

4．1．1 测序用水稻材料和群体

4．1．2 主要试剂与配方

4．2 实验方法

4．2．1 表型测定

4．2．2 片段PCR扩增

4．2．3 片段TA克隆及检测

4．2．4 RNA提取和cDNA第一链的合成

4．2．5 实时荧光定量PCR

4．2．6 Southern blotting

4．3 结果与分析

4．3．1 性状调查与表型比较分析

4．3．2 全基因组测序和比较基因组分析

4．3．3 解析YVB品质性状变异的分子机理-关联表型变异与基因型变异

4．4 讨论

5 结论

5．1 主要结论及综合讨论

5．1．1 主要结论

5．1．2 综合讨论

5．2 本文特色与创新点

5．2．1 主要基于组学的外源DNA导入变异系性状变异分子机理研究有创新性

5．2．2 利用远缘物种间后代扩展比较基因组研究具有创新性

5．2．3 新基因的发掘途径上有特色

5．3 不足和下一步工作计划

5．3．1 变异单株的分子鉴定

5．3．2 不同世代变异单株的遗传、分离规律

5．3．3 外源特异片段的鉴定和验证

5．3．4 表型变异关联基因的定位与克隆

参考文献

附录

攻读学位期间发表的论文与成果

致谢