14-3-3ε对胃癌细胞系SGC7901生物学行为的影响

摘要

目的:
　　研究14-3-3ε的表达水平对胃癌细胞SGC7901细胞增殖、周期及裸鼠皮下成瘤能力的影响及相关机制。
　　方法:
　　①采用靶向干扰14-3-3ε的shRNA转染SGC7901胃癌细胞，用嘌呤霉素进行抗性筛选，挑选单克隆进行增殖培养，用Western Blotting验证14-3-3ε的表达，建立14-3-3ε稳定低表达的细胞系（即转染组）、对照组为转染无干扰作用的shRNA的SGC7901胃癌细胞、未转染组为SGC7901胃癌细胞。
　　②用MTT法检测各组细胞的增殖能力，用流式细胞仪测定细胞周期，检测各组细胞处于细胞分裂周期中不同时期的细胞百分比。
　　③将细胞接种于Balb-c裸鼠前腋部皮下，根据瘤体体积的变化判断各组细胞皮下成瘤能力。
　　④用Western Blotting检测各实验组细胞周期相关蛋白cyclin E和p27kip1的表达。
　　结果:
　　①成功构建14-3-3ε稳定低表达的细胞系。
　　②MTT比色法转染组吸光度值明显低于未转染组(P＜0.05);流式细胞仪细胞周期分析转染组处于G1/G0期的细胞百分比高于未转染组(P＜0.05)，处于S期的细胞百分比低于未转染组(P＜0.05);裸鼠皮下成瘤实验转染组瘤体体积增长明显慢于未转染组(P＜0.05)。
　　③WesternBlotting结果发现转染组cyclin E蛋白表达下调，显著低于未转染组(P＜0.05)，而p27kip1蛋白表达上调，显著高于未转染组(P＜0.05)。
　　结论:
　　①成功建立了用shRNA进行RNA干扰的14-3-3ε稳定低表达的SGC7901胃癌细胞株;
　　②通过下调SGC7901胃癌细胞中14-3-3ε蛋白的表达使胃癌细胞增殖抑制、细胞周期G1/S期阻滞及裸鼠皮下成瘤能力降低，14-3-3ε可望成为胃癌诊断的指标和靶向治疗的靶点;
　　③下调SGC7901胃癌细胞14-3-3ε表达使cyclin E表达下调，p27kip1的表达上调，提示其抗肿瘤作用与细胞周期的调控有关。

目录

声明

摘要

英汉缩略词名词对照表

第一章 前言

技术路线

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株、shRNA、裸鼠

2．1．2 主要实验试剂及耗材

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试剂配置

2．2 实验方法

2．2．1 人胃癌SGC7901细胞的复苏、培养和冻存

2．2．2 嘌呤霉素筛选浓度确定

2．2．3 质粒转染

2．2．4 嘌呤霉素抗性筛选

2．2．5 抗性克隆扩大培养

2．2．6 Western Blotting验证干扰效果

2．2．7 MTT细胞增殖试验

2．2．8 流式细胞仪测定细胞周期

2．2．9 裸鼠成瘤实验

2．2．10 统计学分析

第三章 实验结果

3．1 稳定转染细胞株的建立

3．2 Western Blotting验证14-3-3ε的表达

3．3 14-3-3ε表达水平对胃癌细胞SGC7901增殖能力的影响

3．4 14-3-3ε表达水平对胃癌细胞SGC7901周期的影响

3．5 14-3-3ε表达水平对胃癌细胞SGC7901裸鼠皮下成瘤能力的影响

3．6 14-3-3ε表达水平对细胞周期相关蛋白cyclin E和p27kip1的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 14-3-3蛋白及其相关的信号转导通路

致谢