冠心病患者单核细胞基因组总体甲基化水平及TLR4启动子甲基化水平研究

摘要

目的：探讨冠心病患者外周血CD14+单核细胞基因组DNA总体甲基化水平以及特异基因TLR4(toll-like receptor4)启动子甲基化水平，为阐明冠心病患者外周血CD14+单核细胞的异常活化提供理论依据。
　　方法：密度梯度离心法和磁珠分选法分离20例冠心病患者和11例冠脉造影阴性对照的外周血CD14+单核细胞，抽提基因组DNA、总RNA和总蛋白，采用基因组总体甲基化定量试剂盒检测冠心病组和对照组DNA总体甲基化水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测甲基化相关基因包括DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)和甲基结合蛋白2(methyl binding protein2，MBD2)以及TLR4的mRNA表达水平;Western-blot检测TLR4的蛋白表达水平;亚硫酸氢钠测序检测TLR4基因启动子的甲基化水平;ELISA法检测血浆中炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor alpha，TNF-α)、IL-6及单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotactic protein1，MCP-1)的水平。
　　结果：与对照组相比，冠心病组(1)血浆炎症因子TNF-α、IL-6及MCP-1表达显著上调（P值分别为P=0.0274，P=0.0295，P=0.0026）;(2) CD14+单核细胞DNA总体甲基化水平明显升高(P=0.0168);(3) DNMT1mRNA水平明显降低，而DNMT3A和DNMT3B的mRNA水平明显升高(P值分别为P=0.0185，P=0.0253和P=0.0089)，MBD2 mRNA水平明显降低(P=0.0373)(4)相关性分析表明，DNMT1和DNMT3B的mRNA表达水平与DNA总体甲基化水平呈明显正相关，MBD2的mRNA表达水平与DNA总体甲基化水平呈显著负相关，而表达升高的DNMT3A与总体甲基化水平没有明显相关性;(5) TLR4 mRNA和蛋白表达水平显著上调（P=0.0296和P=0.0409）;(6) TLR4启动子核心调控区-370至-1163bp的4个CpG位点平均甲基化水平明显降低（P=0.0235），其中-421bp位点的甲基化水平明显降低（P=0.0107），-455bp，-631bp，-1086bp三个位点的甲基化水平与对照组相比均无显著性差异;(7)相关性分析表明，TLR4启动子区甲基化水平与TLR4 mRNA表达水平呈显著负相关（r=-0.758，P=0.018）;(8) TLR4 mRNA表达水平与DNMT1 mRNA表达水平呈显著负相关（r=-0.683，P=0.014）。
　　结论：(1)冠心病患者血浆TNF-α、IL-6及MCP-1表达显著上调，提示机体处于炎症状态以及单核细胞的活化状态;
　　(2)冠心病患者外周血CD14+单核细胞基因组DNA呈总体高甲基化，可能是DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)和甲基结合蛋白MBD2共同作用的结果;
　　(3)外周血CD14+单核细胞TLR4基因表达显著上调，可能是由TLR4基因启动子区的异常低甲基化所调控的，并且TLR4 mRNA表达水平与DNMT1 mRNA表达水平呈显著负相关，提示DNMT1可能介导了TLR4基因启动子区的低甲基化。

目录

声明

摘要

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要仪器设备、试剂及耗材

2．1．2 其他常用试剂

2．1．3 常用试剂配制

2．2 方法

2．2．1 CD14+单核细胞的分离

2．2．2 酶联免疫吸附法ELISA检测血浆中炎症因子TNF-α、IL-6及MCP-1的水平

2．2．3 RNA的抽提

2．2．4 逆转录

2．2．5 实时定量Realtime-PCR反应

2．2．6 CD14+单核细胞基因组DNA提取及鉴定

2．2．7 CD14+单核细胞基因组总体甲基化水平测定

2．2．8 Western blot检测TLR4蛋白水平的表达

2．2．9 亚硫酸盐测序

2．3 统计学方法

3 结果

3．1 实验对象

3．2 冠心病患者血浆炎症因子TNF-、IL-6、MCP-1的表达水平

3．3 冠心病患者外周血CD14+单核细胞基因组总体甲基化水平

3．4 冠心病患者外周血CD14+单核细胞DNMTs及MBD2 mRNA表达水平

3．5 冠心病患者外周血CD14+单核细胞的总体用基化与DNMTs和MBD2的相关性分析

3．6 冠心病患者外周血CD14+单核细胞TLR4mRNA和蛋白表达

3．7 冠心病患者外周血CD14+单核细胞TLR4启动子甲基化水平

3．8 冠心病患者外周血CD14+单核细胞TLR4启动子甲基化水平与TLR4mRNA表达的相关性分析

3．9 冠心病患者外周血中CD14+单核细胞TLR4 mRNA表达和DNMT1mRNA表达的相关性分析

4 讨论

参考文献

附录

综述 TLR4 signaling：a potential therapeutic target in ischemic coronary artery disease

攻读学位期间学术成果

致谢