骨肉瘤中ATF3基因调节P53鞠躬小分子化合物RITA诱导的细胞凋亡的机制研究

摘要

目的:骨肉瘤(osteosarcoma)是较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约为小儿肿瘤的5％。骨肉瘤起源于间叶组织，恶性程度高，侵袭性强，较早出现肺部转移，因而骨肉瘤患者的预后非常差，患者生存率很低，截肢后5年存活率仅为5-15％。现如今分子靶向治疗的出现，给骨肉瘤患者带来了新的福音。应激反应基因ATF3是P53的一个重要靶基因，在多种癌症中具有抑癌基因的作用，ATF3基因能调控细胞死亡，细胞周期。RITA(reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis)是一种P53靶向小分子抗癌化合物，诱导P53及其靶基因表达，在许多细胞系中导致大量细胞凋亡。本课题研究了ATF3基因在抗癌化合物RITA诱导的骨肉瘤细胞(U2OS)凋亡中起到的调节作用。
　　方法:不同浓度及时间长度RITA刺激骨肉瘤细胞系(U2OS)，通过Westerblot及荧光定量PCR测定ATF3蛋白及mRNA表达水平。将ATF3沉默载体转入骨肉瘤细胞系(U2OS)，建立稳定细胞系，RITA处理细胞，用MTT、流氏细胞术测定细胞凋亡水平，通过Westerblot及荧光定量PCR测定ATF3下游凋亡调控基因DR5、PUMA的蛋白及mRNA水平。
　　结果:
　　1、用0.2uM RITA处理U2OS细胞后，取0，2，4，8，12，24小时收取蛋白及mRNA后，用westernblot及q-RTPCR检测ATF3蛋白及mRNA水平。结果显示:第0小时（即空白对照组）ATF3蛋白及mRNA表达水平极低，从第2小时开始ATF3蛋白及mRNA水平显著升高，而且随着时间延长ATF3蛋白及mRNA水平也随之增高，说明RITA对ATF3蛋白及mRNA水平的诱导具有时间依赖性。选取0uM，0.05uM，0.1uM，0.2uM，0.5uM，1uM RITA处理U2OS细胞24小时后收取蛋白及mRNA，用westernblot及q-RTPCR检测ATF3蛋白及mRNA水平。结果显示:未用RITA处理的细胞（即空白对照组）ATF3蛋白及mRNA表达水平极低，而随着RITA浓度增加，ATF3蛋白及mRNA水平显著升高，说明RITA对ATF3蛋白及mRNA水平的诱导具有浓度依赖性。
　　2、ATF3 siRNA转染U2OS细胞系，分为:空白对照组，空白对照组+RITA，siATF3组，siATF3+RITA组，0.2uM RITA诱导时间为24小时，westernblot结果显示ATF3 siRNA转染U2OS细胞后，对比空白对照组及空白对照组+RITA组，siATF3组及siATF3+RITA组均很难检测到ATF3蛋白表达。
　　3、用不同浓度RITA处理空白对照组及两个ATF3沉默组，MTT结果显示，RITA的不同浓度在固定的时间(72h)对骨肉瘤细胞的抑制作用存在差异，抑制作用随浓度的增大而增加;在同一浓度中，ATF3沉默组细胞较空白对照组对RITA的抵抗力显著增强。
　　4、流式细胞术测定细胞凋亡siATF3组对比空白对照组，细胞凋亡率差别无统计学意义，siATF3+RITA组对比空白对照组+RITA组，细胞凋亡率显著降低。
　　5、westernblot结果显示:siATF3组对比空白对照组，DR5、PUMA蛋白水平均显著降低，siATF3+RITA组对比空白对照组+RITA组，DR5、PUMA蛋白水平也显著降低。q-RTPCR结果显示:siATF3组对比空白对照组，DR5、PUMA mRNA水平无明显差异;siATF3+RITA组对比空白对照组+RITA组，DR5、PUMA mRNA水平显著降低。
　　结论:
　　1、RITA诱导ATF3基因在骨肉瘤细胞U2OS中高表达。
　　2、骨肉瘤细胞系U2OS中ATF3沉默后RITA无法诱导ATF3蛋白表达。
　　3、ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强。
　　4、ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强是通过调控下游凋亡基因实现的。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．2 主要仪器及耗材

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养实验

2．3．2 qRT-PCR实验

2．3．3 琼脂糖凝胶电泳

2．3．4 Western-bloting实验

2．3．5 细胞转染

2．3．6 MTT法测细胞凋亡

2．3．7 流式细胞检测测定细胞凋亡

第三章 结果

3．1 RITA诱导ATF3基因在骨肉瘤细胞U2OS中高表达

3．2 骨肉瘤细胞系U2OS中ATF3沉默后RITA无法诱导ATF3蛋白表达

3．3 MTT显示ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强

3．4 流式细胞术显示ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强

3．5 ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强是通过调控下游凋亡基因实现的

第四章 讨论

参考文献

综述 ATF3转录因子——免疫和癌症中的新角色

致谢