CTNNAL1对肺应激损伤上皮修复和间质修复的平衡点调控

摘要

肺和气道作为内外环境相互作用的第一道界面，经常遭受来自外环境的应激刺激或损伤，构成许多肺部疾病甚至全身性疾病的启动基础。气道上皮是肺脏应激的首道防线，受损后的气道上皮立即启动修复过程，包括可逆的上皮修复和不可逆的间质修复。上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指细胞由上皮表型向间质表型转变的过程。EMT的发生是纤维化中肌成纤维细胞的重要来源，是介于正常组织损伤后上皮修复和间质修复之间一个极重要的生物学过程。受损的肺组织如何选择不同类型的修复机制，可能取决于其表达的具有感知周边环境和自身状态功能的粘附分子谱。本课题组前期研究发现连环素(catenin)家族成员CTNNAL1(catenin alpha-like1)在哮喘病人气道粘膜中表达下调;体外实验发现CTNNAL1参与气道应激反应，促进人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells，HBECs)增殖和损伤修复，提示CTNNAL1不仅仅是一种结构性粘附分子，还能响应应激，对气道上皮细胞的应激和修复功能应该具有保护性的作用。因此，本研究假设在肺脏应激损伤与修复的过程中，CTNNAL1在上皮细胞中发挥积极影响，对肺损伤后上皮修复与间质修复起平衡调控作用。
　　目的:
　　本课题拟用臭氧作为应激刺激，构建人支气管上皮细胞EMT模型，并观察CTNNAL1对气道上皮细胞EMT的影响，探讨CTNNAL1在气道上皮损伤和修复过程中的作用。
　　方法:
　　(1)体外培养人支气管上皮细胞系(HBECs)，用臭氧进行应激刺激，构建EMT模型，用实时荧光定量PCR，Western blot法和细胞免疫组化法鉴定上皮和间质标记物的表达。
　　(2)体外培养CTNNAL1高表达和沉默的HBE稳定转染细胞系，采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测臭氧应激下CTNNAL1不同表达水平HBECs上皮和间质标记物的表达，观察CTNNAL1对EMT的影响。
　　(3)ELISA法检测臭氧应激下各组HBECs中TGF-β1的分泌情况。
　　结果:
　　(1)臭氧应激可使HBECs上皮标记物表达降低，间质标记物表达增高，符合EMT表型。
　　(2)CTNNAL1高表达促进臭氧应激后HBECs上皮标记物表达，抑制间质标记物表达，抑制EMT发生;CTNNAL1沉默后作用相反。
　　(3)臭氧应激后，HBECs分泌的TGF-β1表达增多;CTNNAL1高表达下调HBECs分泌的TGF-β1，CTNNAL1沉默后增加TGF-β1的表达量。
　　结论:
　　(1)成功构建臭氧应激人支气管上皮细胞的EMT模型。
　　(2)臭氧应激人支气管上皮细胞内源性TGF-β1分泌增多。
　　(3)CTNNAL1可减少内源性TGF-β1分泌并抑制臭氧应激诱发的人支气管上皮细胞EMT作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 HBECs臭氧应激下EMT模型的构建及鉴定

1．1 材料与方法

1．1．1 主要试剂

1．1．2 主要仪器和设备

1．1．3 永生化人支气管上皮细胞株(16HBE14O-)的培养

1．1．4 臭氧应激条件摸索

1．1．5 实时荧光定量PCR检测臭氧对HBECs上皮及间质细胞标志物的mRNA表达水平

1．1．6 Western blot法检测臭氧对HBECs上皮及间质细胞标志物的蛋白表达水平

1．1．7 细胞免疫组化法检测臭氧对HBECs上皮及间质细胞标志物的表达水平

1．1．8 ELISA法检测臭氧对HBECs内源性TGF-β1的表达水平

1．1．9 统计学处理

1．2 结果

1．2．1 HBECs臭氧应激构建EMT模型的条件摸索

1．2．2 成功构建HBECs臭氧应激下EMT模型

1．2．3 臭氧应激下HBECs内源性TGF-β1的表达上调

1．3 讨论

第二章 CTNNAL1对臭氧应激下HBECs发生EMT的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 稳定转染细胞系培养

2．1．4 实时荧光定量PCR检测臭氧应激下各组HBECs上皮及间质细胞标志物的mRNA表达水平

2．1．5 Western blot法检测臭氧应激下各组HBECs上皮及间质细胞标志物的蛋白表达水平

2．1．6 ELISA法检测臭氧应激下各组HBECs内源性TGF-β1的表达水平

2．1．7 统计学处理

2．2 结果

2．2．1 CTNNAL1不同表达水平稳定转染细胞系验证

2．2．2 CTNNAL1抑制HBECs臭氧应激下EMT的发生

2．2．3 CTNNAL1抑制臭氧应激下HBECs内源性TGF-β1的表达

2．3 讨论

第三章 结论

参考文献

综述 E-cadherin和Catenin家族对EMT的作用

攻读硕士期间主要的研究成果

致谢