抗病毒先天性免疫通过调控肺上皮干/祖细胞表达及损伤/修复反应介导COPD气道重建和肺泡稀薄化

摘要

第一部分、肺上皮干/祖细胞的筛选和鉴定
　　 目的：分离、筛选和鉴定肺上皮干/祖细胞，分析其与肺上皮修复反应的关系。
　　 方法：首先从小鼠肺组织中获取单个肺细胞悬液，通过流式细胞术检测CD45-/CD31-/Sca-1+(Stem Cell Antigen-1)细胞在正常小鼠肺内的表达水平及其细胞周期，并采用流式细胞分选术从肺单细胞悬液中筛选出该细胞群，使用免疫荧光染色对其具体细胞成分进行鉴别，体外培养评估其增殖能力，最后通过病毒病原相关分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMP)感染模型明确该细胞群与肺上皮修复反应的关系。
　　 结果：正常小鼠肺内有低水平的CD45-/CD31-/Sca-1+细胞表达。与CD45-/CD31-/Sca-1-细胞相比，CD45-/CD31-/Sca-1+细胞主要处于DNA合成期或合成后期/分裂期，且在体外培养过程中仅CD45-/CD31-/Sca-1+细胞分裂增殖形成细胞集落；细胞免疫荧光染色显示CD45-/CD31-/Sca-1+细胞主要由细支气管肺泡干细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞和Clara细胞组成。这些体外实验结果表明具有增殖能力的CD45-/CD31-/Sca-1+细胞是一个异质干/祖细胞群。之后体内实验的结果发现在病毒双链RNA(dsRNA)模拟物Poly(I：C)诱导肺上皮细胞凋亡的同时，肺CD45-/CD31-/Sca-1+细胞的表达水平出现上升，并随着凋亡程度的加重而逐渐升高；且在此过程中，CD45-/CD31-/Sca-1+细胞表达水平的变化与肺上皮Ki67阳性细胞所呈现的动力学十分相似。由此可知Poly(I：C)刺激同时触发了肺上皮的损伤和修复反应，且肺CD45-/CD31-/Sca-1+细胞参与了肺上皮的再生修复过程。
　　 结论：肺CD45-/CD31-/Sca-1+细胞是具有部分祖细胞特性的异质干/祖细胞群，该细胞群的表达水平代表了Poly(I：C)刺激下肺上皮组织的再生修复反应。
　　 第二部分、香烟烟雾和病毒PAMP联合诱导的COPD小鼠模型中肺上皮干/祖细胞表达和损伤/修复失衡
　　 目的：观察COPD(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)肺组织中上皮干/祖细胞的表达及不同解剖区域上皮的损伤/修复反应。
　　 方法：通过香烟烟雾(Cigarette Smoke，CS)和病毒PAMP模拟物Poly(I：C)联合暴露建立肺损伤模型，检测该模型肺组织中气道和肺泡的病理改变，采用流式细胞术检测肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞群在COPD肺组织中的表达水平，通过TUNEL和Ki67等免疫荧光染色分别观察气道和肺泡上皮细胞的凋亡和增殖情况。
　　 结果：香烟烟雾和Poly(I：C)联合暴露的小鼠肺组织中出现显著气道壁增厚和肺泡结构破坏，是成功模拟了气道纤维化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；在该COPD模型中，肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞表达上调，但与Poly(I：C)组比较其表达水平明显下降，表明香烟烟雾抑制了Poly(I：C)诱导的肺上皮干/祖细胞扩增；TUNEL染色和免疫荧光染色显示模型中气道上皮细胞以增殖反应为主，而肺泡上皮细胞以凋亡反应为主。
　　 结论：香烟烟雾和病毒PAMP模拟物Poly(I：C)联合暴露诱导的小鼠肺损伤模型是同时模拟了COPD小气道纤维化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；香烟烟雾抑制了Poly(I：C)诱导的肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞扩增，提示香烟烟雾和Poly(I：C)联合暴露刺激通过影响肺上皮干/祖细胞的表达导致异常的肺上皮修复反应；在该COPD模型中气道和肺泡上皮呈现相反的上皮细胞损伤/修复失衡：气道上皮以增殖反应为主，而肺泡上皮则以凋亡反应为主，与观察到的气道纤维化重建和肺泡稀薄化改变一致，提示肺上皮损伤/修复失衡参与COPD肺组织重建。
　　 第三部分、抗病毒先天性免疫对COPD中肺上皮干/祖细胞和损伤/修复反应的影响
　　 目的：检测抗病毒先天性免疫TLR3(Toll-Like Receptor3)和RLH-MAVS(RIG-Like Helicases-Mitochondrial Antiviral SignalingProtein)信号通路对COPD肺组织中上皮干/祖细胞表达和不同解剖区域上皮损伤/修复反应的影响。
　　 方法：使用野生型(Wild Type，WT)、TLR3基因敲除(TLR3-/-)及MAVS基因敲除(MAVS-/-)小鼠重复香烟烟雾和Poly(I：C)联合暴露诱导的COPD模型，检测各型小鼠肺组织中气道和肺泡的病理改变，流式细胞术检测CD45-/CD31-/Sca-1+肺上皮干/祖细胞的表达水平，并通过TUNEL和Ki67等免疫荧光染色分别观察气道和肺泡上皮细胞的凋亡和增殖情况。
　　 结果：香烟烟雾和Poly(I：C)联合暴露后，TLR3-/-和MAVS-/-小鼠肺组织中炎性细胞浸润程度和CD45-/CD31-/Sca-1+细胞表达均较WT小鼠明显下降，敲除MAVS基因同时逆转了气道纤维化重建和肺泡稀薄化，而敲除TLR3基因仅改善了气道增生和纤维化。TUNEL和免疫荧光染色的结果显示TLR3和MAVS表达缺失均同时抑制了肺上皮细胞的凋亡和增殖反应，但在CS+P暴露的TLR3-/-小鼠肺组织中，气道上皮细胞凋亡/增殖水平几乎持平，肺泡上皮中增殖细胞比例明显低于凋亡细胞比例；而CS+P暴露的MAVS-/-小鼠气道和肺泡上皮细胞凋亡/增殖水平均接近同一水平，说明敲除MAVS基因能够同时逆转CS+P诱导的气道上皮过度修复和肺泡上皮的修复不足，而TLR3基因缺失仅抑制了气道上皮的过度修复。
　　 结论：在香烟烟雾和Poly(I：C)诱导的COPD模型中，TLR3和RLH-MAVS信号通路参与和促进了肺组织炎症，并通过调控肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖细胞表达以及上皮细胞凋亡和增殖反应介导肺组织重建，其中，气道上皮呈现修复过度的损伤/修复失衡主要受到TLR3信号通路的调控，而肺泡上皮表现为修复不足的损伤/修复失衡主要受到RLH-MAVS信号通路的调控。