HDAC1和HDAC2在罗哌卡因缓解CCI大鼠慢性疼痛的机制中的应用

摘要

目的:
　　局麻药目前已被广泛用于手术麻醉和急性疼痛治疗。最近的临床和基础研究发现鞘内注射局麻药也可以缓解神经病理性疼痛，但是其具体机制不清。因为钠通道阻滞被认为是局麻药的主要的作用机制，而鞘内注射低于钠通道阻滞的浓度的局麻药即获得缓解神经病理性的效果，而且局麻药的镇痛作用维持时间长于药物半衰期。
　　越来越多的证据支持表观遗传学机制参与了神经病理性疼痛的形成过程。神经病理性疼痛的重要特征是神经元的可塑性改变，不可再生的神经元细胞可塑性改变主要依赖于表观遗传学机制;而且，长期记忆和慢性疼痛的机制类似，长时程记忆中的表观遗传学改变可能同样适用于慢性疼痛。
　　本实验分两部分，第一部分拟证实连续鞘内注射0.25％的罗哌卡因有缓解慢性疼痛作用建立了坐骨神经结扎模型，第二部分拟分子水平探索CCI手术后不同时间点神经病理性疼痛调节中枢—脊髓去乙酰化水平的变化及鞘内注射0.25％罗哌卡因对这种变化的影响。此外还初步探索了去乙酰化酶可能的作用的位点GDNF。
　　方法:
　　1.鞘内置管成功5天后的成年雄性SD大鼠30只，随机分为3组:Sham+NS组(n=10)，CCI+NS组(n=10)和CCI+Ropivacaine组(n=10)。Sham+NS和CCI+NS组术后第7～13天连续7天注射生理盐水;CCI+Ropivacaine组手术后连续7天注射0.25％罗哌卡因;术前1，3天及术后3、7、10、14、15、16、17、21天分别对左右足掌“花环”中央的机械痛阈和热痛阈进行评价，第7、10天行为学于鞘内注射前测量。术后第14天处死大鼠，取腰膨大组织用于后续分子生物学研究。
　　2.体重200～250g的成年雄性SD大鼠35只，随机分为3组:Na(i)ve组(n=5)，不做任何处理;Sham组(n=15)，仅暴露左侧坐骨神经而不结扎;CCI组(n=15)，按Bennett和Xie的方法建立左侧CCI模型。术前1，3天及术后3、7、10、14、21天分别对左右足掌“花环”中央的机械痛阈和热痛阈进行评价。于术后7，10，14天处死大鼠，取腰膨大组织，和前一部分用于Western blot的标本一起用于检测I类组蛋白去乙酰化酶:组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2);以及胶质细胞源性生长因子GDNF在脊髓中的蛋白表达水平。于术后14天处死大鼠，灌注固定后行冰冻切片和前一部分用于免疫荧光的标本一起进行HDAC1，HDAC，GDNF的免疫荧光染色及HDAC1、HDAC2荧光双标进行细胞定位。
　　结果:
　　1.三组大鼠术前痛阈无明显区别(P＞0.05)。与Sham+NS组比较，CCI+NS组机械痛阈和热痛阈降低(P＜0.05)。与CCI+NS比较，CCI+Ropi组在罗哌卡因注射后的CCI术后D14、D15天机械痛阈和D10天、D14、D15天热痛阈有所增加，(p＜0.05)但此后D16，D17、D21天的痛阈差别无统计学意义(P＞0.05)。与CCI+NS组比，D14天脊髓HDAC1 HDAC2的蛋白表达减少(P＜0.05)，而GDNF蛋白表达则增加(P＜0.05)。CCI+Ropi组D14天脊髓背角HDAC1、HDAC2免疫荧光的阳性细胞数增加(P＜0.05);
　　2.三组大鼠术前机械痛和热痛阈差异无统计学意义，Sham组和na(i)ve组热痛阈和机械痛阈无明显变化(P＞0.05)。与Sham组相比，CCI组第3天开始出现机械痛阈和热痛阈的降低，第14天达峰，有统计学意义(P＜0.05);CCI组脊髓HDAC1，HDAC2蛋白表达量较Sham组增加，有统计学意义(P＜0.05) GDNF蛋白表达量较Sham组减少(P＜0.05);CCI组第14天标本脊髓背角HDAC1，HDAC2免疫荧光阳性细胞数目较sham组增加(P＜0.05)，而GDNF免疫荧光阳性面积比Sham组减少(P＜0.05)
　　结论:
　　1.CCI大鼠术后逐渐出现明显的痛觉敏感，脊髓腰膨大HDAC1、HDAC2蛋白表达量的变化与行为学变化基本一致，GDNF表达量与行为学变化相反。
　　2.鞘内连续注射0.25％的罗哌卡因可以缓解CCI大鼠的疼痛学行为，与CCI+NS组，CCI+Ropi组D14天HDAC1、HDAC2蛋白表达量以及免疫荧光阳性细胞数目有所减少，与行为学变化相符，而GDNF表达量免疫荧光阳性面积增加，与行为学变化相反。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词简表

前言

第一章 鞘内注射罗哌卡因缓解CCI大鼠慢性疼痛

1．1 材料

1．1．1 实验动物

1．1．2 主要仪器设备和实验耗材

1．1．3 主要试剂配制

1．2 方法

1．2．1 实验动物分组

1．2．2 大鼠鞘内置管模型制作

1．2．3 建立左侧CCI模型、鞘内给药

1．2．4 一般情况的观察

1．2．5 机械痛阈的测定Mechanical withdrawal threshold(MWT)

1．2．6 热痛阈的测定Thermal withdrawal latency(TWL)

1．2．7 标本收集

1．2．8 数据处理和统计学分析

1．3 结果

1．3．1 一般情况

1．3．2 机械痛阈

1．3．3 热痛阈的测定

1．4 讨论

1．4．1 大鼠CCI模型的建立

1．4．2 大鼠鞘内置管给药方式的选择

1．4．3 给药浓度的选择

1．5 结论

第二章 CCI大鼠不同时间点脊髓HDAC1、HDAC2、GDNF表达水平及鞘内注射罗哌卡因对三者的影响

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要主要仪器设备和实验耗材

2．1．3 主要试剂配制

2．2 方法

2．2．1 实验动物及分组

2．2．2 CCI模型的制作

2．2．3 一般情况的观察

2．2．4 机械痛阈的测定(MWT)

2．2．5 热痛阈测定(TWT)

2．2．6 标本收集

2．2．7 Western blot法检测大鼠腰膨大HDAC1，HDAC2，GDNF蛋白表达

2．2．8 免疫荧光法测脊髓HDAC1，HDAC2的表达

2．2．9 荧光双标对脊髓HDAC1、HDAC2进行细胞定位

2．2．10 数据处理和统计学分析

2．3 结果

2．3．1 一般情况

2．3．2 机械痛阈的改变

2．3．3 热痛阈改变

2．3．4 WB检测CCI大鼠各个时间点脊髓腰膨大HDAC1，HDAC2，GDNF表达的变化

2．3．5 WB检测罗哌卡因干预对大鼠脊髓腰膨大HDAC1，HDAC2，GDNF表达的影响

2．3．6 免疫荧光检测CCI大鼠HDAC1，HDAC2， GDNF表达变化

2．3．7 免疫荧光检测罗哌卡因干预对HDAC1，HDAC2，GDNF表达的影响

2．3．8 HDAC1，HDAC2免疫荧光双标细胞定位

2．4 讨论

2．4．1 CCI大鼠组蛋白乙酰化改变

2．4．2 CCI大鼠GDNF表达改变

2．4．3 罗哌卡因可能通过抑制HDAC1、HDAC2的去乙酰化酶途径增加下游GDNF基因的表达缓解神经病理性疼痛

2．5 结论

全文结论

参考文献

综述 局麻药缓解神经病理性疼痛的机制

致谢