炎症诱导的S100a8/a9活化转录因子Id3促进结直肠癌进展的机制研究

摘要

目的:结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)与结直肠癌的发生密切相关，但结肠炎相关性癌(colitis-associated cancer，CAC)的发病机制仍不清楚。
　　S100a8和S100a9是S100蛋白家族成员，介导炎症性肠病、类风湿性关节炎等“非可控性炎症”的病理改变及胃癌、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。
　　本课题组前期对溃疡性结肠炎癌变过程不同阶段的动态分子机制进行了研究，发现S100a8和S100a9在“炎-癌”各期中的表达水平显著上调，提示两者可能参与溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的发病过程。本研究主要探讨S100a8和S100a9在结肠炎相关性癌发生和进展中的作用机制，希望为结直肠癌的生物治疗提供新靶点。
　　方法:免疫组化、qRT-PCR、GEO数据库分析S100a8和S100a9在小鼠“炎-癌”模型、人结直肠炎、结直肠腺瘤、结直肠癌及癌旁组织中的表达;利用脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7模拟炎症细胞模型，qRT-PCR、ELISA检测、分析S100a8和S100a9表达及分泌的机制;MTT、Transwell检测S100a8和S100a9对小鼠结肠癌细胞CT26.WT增殖能力及对巨噬细胞RAW264.7招募作用的影响;基因表达谱芯片分析S100a8和S100a9在CT26.WT细胞中发挥生物学功能的下游调控网络及关键节点，并在细胞水平加以验证。
　　结果:S100a8和S100a9在溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠“炎-癌”模型各期中均显著高表达。GEO数据库分析发现，与正常人结直肠组织相比，S100a8和S100a9在溃疡性结肠炎、结直肠腺瘤及结直肠腺癌中的表达水平显著升高。免疫组化检测S100a8和S100a9蛋白在104例结直肠癌组织及58例癌旁组织的表达，发现其表达水平在结直肠癌中显著上调，且S100a8在转移结直肠癌组织及低分化结直肠癌组织中表达水平最高。
　　LPS刺激巨噬细胞RAW264.7，可诱导S100a8和S100a9表达和分泌，其中S100a8的表达与PI3K和P38 MAPK信号通路的激活相关，而S100a9的表达则与NF-κB及PI3K信号通路的激活相关。MTT和Transwell实验表明，小鼠S100a8和S100a9重组蛋白能促进结直肠癌细胞CT26.WT的增殖，招募巨噬细胞RAW264.7。
　　小鼠 S100a8和 S100a9重组蛋白刺激结肠癌细胞CT26.WT后，利用基因芯片分析细胞的基因表达谱变化，发现:S100a8和S100a9均能激活TGF-β信号通路并上调Id家族的表达，其中Id3上调水平最为明显。实验发现，Id3能促进结直肠癌细胞的增殖及细胞周期的进程，其对p21的抑制作用可能是Id3发挥功能的潜在机制。此外，干扰Akt1和Smad5的表达后，可抑制Id3的表达，并上调p21的表达。S100a8/a9活化Id3可能是通过激活Akt1-TGF-β/Smad5信号通路实现。
　　结论:1、S100a8和S100a9在化学物质诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠“炎-癌”模型及人结直肠炎、结直肠腺瘤及结直肠腺癌组织中高表达，参与结直肠炎癌变过程。2、炎症诱导的S100a8和S100a9高表达有助于招募巨噬细胞，促进结肠癌细胞增殖。3、S100a8/a9通过Akt1-TGF-β/Smad5-Id3-p21信号轴，促进结肠癌细胞增殖和细胞周期进程。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞

2．1．2 人结直肠癌患者组织标本

2．1．3 关键试剂的配制

2．1．4 试剂及试剂盒

2．1．5 主要实验仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞／组织总RNA抽提

2．2．2 RNA中痕量DNA消化

2．2．3 RNA质量检测

2．2．4 RNA逆转录

2．2．5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

2．2．6 免疫组化方法及结果判读

2．2．7 酶联免疫吸附实验(ELISA)

2．2．8 MTT增殖实验

2．2．9 Transwell体外侵袭实验

2．2．10 pIRES-S100a8和pIRES-Id3表达载体的构建

2．2．11 siRNA／质粒转染实验

2．2．12 蛋白免疫印迹(Western blot)

2．2．13 流式细胞术(FAM)分析细胞周期变化

2．2．14 mRNA表达谱芯片

2．2．15 芯片数据分析

2．2．16 差异基因的筛选

2．2．17 mRNA表达谱的生物信息学分析

2．2．18 统计学分析

3 结果

3．1 S100a8和S100a9在AOM／DSS诱导的小鼠“炎-癌”模型中高表达

3．2 S100A8和S100A9在人结直肠炎、腺瘤及腺癌组织中高表达

3．3 S100a8和S100a9表达上调的机制及其招募巨噬细胞并促进结肠癌细胞增殖的作用

3．4 S100a8和S100a9影响结肠癌细胞生物学功能所涉及的信号通路及靶基因

3．5 Id3促进结肠癌细胞增殖及细胞周期进展

3．6 S100a8激活Akt1-TGFβ／Smad5活化Id3并下调p21

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 S100A8／A9在炎症和肿瘤中的研究进展

攻读学位期间主要的研究成果目录

致谢